Очищение сродства хлоропласта Translocon белковых комплексов с помощью тега крана

1. Подготовка Arabidopsis растений Подготовка 1 Л половину численность среднего включая витамины с 1% сахарозы, фотосинтетическую и Скуг (МС) и Отрегулируйте пэ-аш до 5,7 с гидроксидом калия (KOH). Добавить 0,8% phytoagar и автоклав для 20 минут при температуре 120 ° C. Налить 75 мл среды MS на пластину Петри (диаметр 14,5 см, высота 3 см) и позволяют затвердевания на 1 ч. Добавление отцентрифугировать 1,5 мл, 30 мг Arabidopsis thaliana семян и поверхности стерилизации с 70% (v/v) этанола, содержащие 0,05% (v/v) Тритон X-100 за 5 мин, следуют 100% (v/v) этанола за 10 мин удалить этанола. Передать семена стерильные фильтровальная бумага для сушки. Посыпать стерилизованные семена равномерно на MS пластину (каждого генотипа требует по крайней мере 8-10 пластины) и печать каждой пластины с хирургическая лента. Инкубируйте пластины на 4 ° C на два дня в темноте, чтобы синхронизировать прорастания семян. Трансфер в камере роста с следующих свет цикла: 8 h 120 мкмоль m−2 s−1 света и 16 h темных в 22-20 ° C. 2. подготовка HsIgG агарозы бусины Приостановить CNBr активированный агарозы бусины (4 g) в 100 мл 1 мм HCl и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре. Перевести агарозы бусины в спеченных стеклянных фильтр, мыть под вакуумом с 100 мл 100 мм HCl и повторять 2 – 3 раза.Примечание: Precool промывочный раствор до 4 ° C. Ресуспензируйте в агарозном бусины в 1 мл холодного 100 мм HCl и передачи 50 мл конические пластиковых пробирок. Промойте фильтр спеченные стекла с 3 мл 100 мм HCl и передать же трубки жидкости. Спина на 400 × g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант с пипеткой.Примечание: Не сцеживаться трубки. Ресуспензируйте бисер в 50 мл муфта буфера (Таблица 1); перемешать кратко и затем спина на 400 × g 5 мин при 4 ° C. Растворяют в 10 мл буфера муфта 50 мг лиофилизированных гомо сапиенс IgG (Hs-IgG), осторожно перемешать агарозы бусины и инкубировать в Ротари шейкер на ночь при 4 ° C. Спина на 400 × g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант с пипеткой. Вымойте IgG агарозы бусины с 50 мл сцепления буфер и спина на 400 × g 5 мин при 4 ° C. Ресуспензируйте IgG агарозы бусины с 50 мл блокирующий буфер (Таблица 1) и спина на 400 × g 5 мин при 4 ° C. Повторите один раз. Ресуспензируйте IgG агарозы бусины в 50 мл блокировки буфера, вращать смесь для 2 ч в RT и спина на 400 × g 5 мин при 4 ° C. Удалить супернатант и ресуспензируйте IgG агарозы бусины в 200 мл NaCl муфта буфера (Таблица 1). Чтобы заблокировать любые оставшиеся cross-linking CNBr группы, мыть IgG агарозы бусины с 100 мл 0,1 М глицин-HCl, рН 2.8. Спина на 400 × g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант. Вымойте с 0,2 М глицин HCl, рН 2.8, спина на 400 × g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант. Наконец мыть IgG агарозы бусины с 200 мл сверхчистой воды. Вымойте IgG агарозы бусины с 200 мл сверхчистой воды, а затем 200 мл PBS буфера (Таблица 1). Ресуспензируйте IgG агарозы бусины в 20 мл буфера PBS с 0,01% НАН3 (азид натрия) и хранить при 4 ° C. 3. изоляция и солюбилизация мембраны дроби Растереть 10 g трех недель A. thaliana саженцев в жидком азоте с использованием холодного ступку и пестик с песком. Добавить 20 мл холодной, шлифовка буфера (Таблица 1) 10 g земли ткани, хорошо перемешать и оттепели на льду. Фильтр огневки через два слоя быстрой фильтрации материала в 50 мл конические пластиковых пробирок. Замочите быстро Биофильтрационный материал с измельчением буфера до фильтрации. Центрифуга фильтрат 10 мин на 1500 × g при 4 ° C и передачи супернатант охлажденные 50 мл конические пластиковых пробирок, повторить то же шаг еще раз и собирать супернатант. Сохранить 200 мкл пример «Общая часть» и хранить при температуре-80 ° C для последующего анализа Супернатант передать холодной 38.50 мл ультрацентрифуга трубы и топ до 35 мл с холодной заточки буфера. Центрифуги для 1 h на 100 000 × g при 4 ° C в ультрацентрифугирования. Передать супернатант 50 мл конические пластиковых пробирок. Сохраните 200 мкл пример «растворимая фракция» и хранить при температуре-80 ° C для последующего анализа. Вновь приостановите зеленые гранулы с использованием стекла тефлон гомогенизатор, шлифовальные буфера. Центрифуга для 1 h на 100 000 × g при 4 ° C в ультрацентрифугирования и удалить супернатант. Ресуспензируйте зеленые гранулы в 18,75 мл 1 x шлифовальные буфер с использованием гомогенизатора тефлон стекла и добавьте 9,375 мл 1 x шлифовальные буфера. Добавление 9,375 мл раствора 4 x solubilisation (Таблица 1) (содержащие моющего средства TX-100) дать 37,5 мл и Инкубируйте 30 мин на «вращающейся шейкер» при 4 ° C. Центрифуги для 1 h на 100 000 × g при 4 ° C в ультрацентрифугирования. Передать супернатант 50 мл конические пластиковых пробирок. Сохраните 200 мкл пример супернатант (будущий «нагрузка фракция») и хранить при температуре-80 ° C для последующего анализа. Ресуспензируйте гранулы в 37,5 мл шлифовальных буфера. Сохранить образец нерастворимых части и хранить при температуре-80 ° C 4. иммунопреципитации Сбалансировать 100 мкл Упакованные IgG агарозы смолы в буфере A (Таблица 1) и спина на 100 × g 5 мин при 4 ° C. Удалить супернатант и ресуспензируйте IgG агарозы смолы в 100 мкл буфера A при 4 ° C. Передать 37,5 мл растворимых оболочек промывают IgG агарозы смолы и инкубировать на ночь на вращающейся шейкер в 50 мл конические пластиковых пробирок при 4 ° C. Отложениях IgG агарозы смолы на 100 × g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант с пипеткой. Сохранить 200 мкл пример «через поток» и хранить при температуре-80 ° C для последующего анализа. Вымойте IgG агарозы смолы в 37,5 мл буфера A и проинкубируйте втечение 10 мин на вращающейся шейкер. Отложениях IgG агарозы смолы на 100 × g 5 минут при температуре 4 ° C, удалить супернатант с пипеткой, добавить 5 мл измельчения буфера A 15 мл пластиковых пробирок и центрифуги на 100 × г, 4 ° C, 5 мин сохранить 200 мкл пример «Стирка 1» и хранить при температуре-80 ° C для последующего анализа. Повторите 5 мл промывки шаг три раза с буфером а. Осуществлять два последних шага стиральные без ингибиторы (NaF, ингибитор протеазы и PMSF)Примечание: Ингибиторы больше не требуется на данном этапе и пропуск для уменьшения стоимости. Сохраните 200 мкл пример последнего Стиральная шаг «окончательный стирка (Рейсы W6)» и хранить при температуре-80 ° C для последующего анализа. Передать столбец спин 500 мкл IgG агарозы смолы с 35 мкм фильтром и мыть бусины вдвое с 300 мкл ТэВ Элюирующий буфер (Таблица 1) (не содержащие AcTEV) для уравновешивания. Закройте столбце спина. Добавьте 300 мкл ТэВ Элюирующий буфер, содержащий 50 единиц (10 мкл) AcTEV. Подготовьте смесь в трубке перед добавлением смолы. Инкубировать столбце спин с бисером в thermomixer на 16 ° C, 350 об/мин – 2 ч. инвертировать столбце нежно несколько раз каждые 30 мин. Откройте столбце спин, поместите его в новой чистой 1,5 мл трубки и спина на 100 × g 5 минут при температуре 4 ° C для сбора элюата. Сухой (к примеру) 10% (v/v) eluted образца (~ 25 мкл) в центробежных испарителя и использовать для других дальнейшего анализа или масс-спектрометрии. Аликвота оставшиеся элюата (~ 275 мкл) разделены на одиннадцать центрифуги 1,5 мл трубки (25 мкл каждого), сушат в центробежных испарителя и хранить при температуре-80 ° C. Анализ образцов, сохранил всей процедуры, а также элюаты стандартом SDS-PAGE следуют immunoblotting. Для пробоподготовки, осадок 50 мкг из всего (T), нагрузка (L), поток через (FT), вымыть 1 (W1) и 200 мкл мыть 6 (Рейсы W6) хлороформ/метанола извлечения16. Добавьте 10 мкл 2 x SDS-PAGE загрузки буфера (Таблица 1) осажденный образцов и 25 мкл eluted сушеные образца. Вортекс и варить 10 мин при 95 ° C в блоке тепла. Анализ всего (T), нагрузка (L), поток через (FT), мыть 1 (W1), стирать 6 (Рейсы W6) и элюции (E) с использованием антител анти TOC159 для определения эффективности процедуры изоляции immunoblotting.