Purificazione di affinità del cloroplasto Translocon proteina complessi usando il Tag di rubinetto

1. preparazione di piante di Arabidopsis Preparare 1 L di mezza forza di Murashige e Skoog (MS) medie comprese vitamine con 1% di saccarosio e regolare il pH a 5,7 con idrossido di potassio (KOH). Aggiungere 0,8% di phytoagar e autoclave per 20 min a 120 ° C. Versare 75 mL di mezzo di MS per piastra di Petri (diametro 14,5 cm, altezza 3 cm) e consentire la solidificazione per 1 h. Aggiungere un tubo microfuge 1,5 mL, 30 mg di semi di Arabidopsis thaliana e superficie sterilizzare con etanolo al 70% (v/v) contenente 0,05% (v/v) X-100 Triton per 5 min, seguita da 100% (v/v) etanolo per 10 min. rimuovere l’etanolo. Trasferire i semi in carta da filtro sterile per l’essiccazione. Cospargere i semi sterilizzati in modo uniforme su una piastra di MS (ciascun genotipo richiede almeno 8-10 piastre) e ogni piatto con nastro chirurgico della guarnizione. Incubare le piastre a 4 ° C per due giorni al buio per sincronizzare la germinazione del seme. Trasferimento a una camera di crescita con il seguente ciclo di luce: 8 h di 120 µmol m− 2 s− 1 luce e 16 h di dark 22-20 ° c. 2. preparazione di agarosio HsIgG perle Sospendere CNBr-attivato dell’agarosi branelli (4 g) in 100 mL di HCl 1 mM ed incubare per 30 min a temperatura ambiente. Trasferire le perline di agarosio in un filtro di vetro sinterizzato, lavare sotto vuoto con 100 mL di HCl 100 mM e ripetere 2 – 3 volte.Nota: Preraffreddare la soluzione di lavaggio a 4 ° C. Risospendere il perline di agarosio in 1 mL di freddo 100 mM HCl e trasferirlo in una provetta conica per centrifuga da 50 mL. Lavare il filtro di vetro sinterizzato con 3 mL di HCl 100 mM e trasferire il liquido nella provetta stessa. Spin a 400 × g per 5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante con una pipetta.Nota: Non far decantare il tubo. Risospendere le sfere in 50 mL di tampone di accoppiamento (tabella 1); mescolare brevemente e poi girare a 400 × g per 5 min a 4 ° C. Sciogliere 50 mg di liofilizzato Homo sapiens IgG (Hs-IgG) in 10 mL di tampone per l’accoppiamento, mescolare delicatamente le perline di agarosio e incubare in agitatore rotativo durante la notte a 4 ° C. Spin a 400 × g per 5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante con una pipetta. Lavare le perle di IgG-agarosio con 50 mL di accoppiamento buffer e spin a 400 × g per 5 min a 4 ° C. Risospendere le perline di IgG-agarosio con 50 mL di tampone bloccante (tabella 1) e spin a 400 × g per 5 min a 4 ° C. Ripetere una volta. Risospendere IgG-agarosi branelli in 50 mL di tampone bloccante, ruotare la miscela per 2 h a RT e spin a 400 × g per 5 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e risospendere le perline di IgG-agarosio in 200 mL di tampone di accoppiamento di NaCl (tabella 1). Per bloccare gruppi rimanenti cross-linking CNBr, lavare le perle di IgG-agarosio con 100 mL di HCl-glicina di 0,1 M, pH 2.8. Spin a 400 × g per 5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante. Lavare con 0,2 M glicina-HCl, pH 2.8, spin a 400 × g per 5 min a 4 ° C ed eliminare il surnatante. Infine, lavare le perle di IgG-agarosio con 200 mL di acqua ultrapura. Lavare le perle di IgG-agarosio con 200 mL di acqua ultrapura e poi 200 mL di tampone PBS (tabella 1). Risospendere le perline di IgG-agarosio in 20 mL di tampone PBS con 0,01% di NaN3 (sodio azide) e conservare a 4 ° C. 3. isolamento e solubilizzazione della frazione della membrana 10 g di piantine di a. thaliana vecchio di tre settimane in azoto liquido utilizzando un freddo mortaio e pestello con sabbia di frantumazione. Aggiungere 20 mL di freddo macinazione buffer (tabella 1) per 10 g di tessuto terra, mescolare bene e scongelare su ghiaccio. Filtrare l’omogenato attraverso due strati di materiale di filtrazione rapida in una provetta conica per centrifuga da 50mL. Immergere il materiale di filtrazione rapida con rettifica buffer prima della filtrazione. Centrifugare il filtrato per 10 min 1.500 × g a 4 ° C e trasferimento del surnatante in una provetta conica per centrifuga refrigerata 50 mL, ripetere lo stesso passo ancora una volta e raccogliere il surnatante. Conservare un campione di 200 µ l della frazione”totale” e conservare a-80 ° C per un’analisi successiva Trasferire il surnatante in freddo mL 38,50 ultracentrifuga provette e superiore a 35 mL con buffer di rettifica fredda. Centrifugare per 1 h a 100.000 × g a 4 ° C in un’ultracentrifuga. Trasferire il surnatante in una provetta conica per centrifuga da 50 mL. Mantenere un 200 µ l di campione del “frazione solubile” e conservare a-80 ° C per un’analisi successiva. Risospendere il pellet verde utilizzando un omogeneizzatore del teflon di vetro, nel buffer di macinazione. Centrifugare per 1 h a 100.000 × g a 4 ° C in un’ultracentrifuga e scartare il surnatante. Risospendere il pellet verde in 18,75 mL di 1x Buffer utilizzando un omogeneizzatore di teflon vetro di macinazione e aggiungere 9,375 mL di 1x buffer di macinazione. Aggiungere 9,375 mL di soluzione di x solubilisation 4 (tabella 1) (contenente il detergente TX-100) per dare 37,5 mL e incubare per 30 min in un “agitatore rotante” a 4 ° C. Centrifugare per 1 h a 100.000 × g a 4 ° C in un’ultracentrifuga. Trasferire il surnatante in una provetta conica per centrifuga da 50 mL. Conservare un campione di 200 µ l del surnatante (futuro “frazione di carico”) e conservare a-80 ° C per un’analisi successiva. Risospendere il pellet in 37,5 mL di tampone di macinazione. Mantenere il campione da parte insolubile e conservare a-80 ° C 4. immunoprecipitazione Equilibrare 100 µ l di pranzo resina IgG-agarosio in tampone A (tabella 1) e spin a 100 × g per 5 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e risospendere la resina di IgG-agarosio in 100 µ l di tampone A 4 ° c. Trasferire la resina di IgG-agarosio lavata i 37,5 mL di membrane solubilizzate e incubare per una notte su un agitatore rotante in un tubo di centrifuga a fondo conico da 50 mL a 4 ° C. Sedimento l’IgG-agarosio in resina a 100 × g per 5 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante con una pipetta. Mantenere un 200 µ l di campione del “attraversa” e conservare a-80 ° C per un’analisi successiva. Lavare la resina di IgG-agarosio in 37,5 mL di tampone A e incubare per 10 minuti su un agitatore rotante. Sedimento della resina di IgG-agarosio a 100 × g per 5 min a 4 ° C, eliminare il surnatante con una pipetta, aggiungere 5 mL di tampone A di rettifica di una provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare a 100 × g, 4 ° C, 5 min. Mantieni un 200 µ l di campione del “Wash 1” e conservare a-80 ° C per un’analisi successiva. Ripetere i 5 mL fase tre volte con tampone di A. di lavaggio Svolgere gli ultimi due passaggi di lavaggio senza gli inibitori (NaF, inibitore della proteasi e PMSF)Nota: Inibitori non sono necessari in questa fase e omesso per ridurre i costi. Conservare un campione di 200 µ l dell’ultimo lavaggio passo finale “lavaggio” (W6) e conservare a-80 ° C per un’analisi successiva. Trasferire la resina di IgG-agarosio a una colonna di spin 500 µ l con filtro 35 µm e lavare le perle due volte con 300 µ l di tampone di eluizione di TEV (tabella 1) (non contenente AcTEV) di equilibramento. Chiudere la colonna di spin. Aggiungere 300 µ l di tampone di eluizione di TEV contenente 50 unità (10 µ l) di AcTEV. Preparare la miscela in un tubo prima di aggiungere alla resina. Incubare la colonna di spin con perline in un thermomixer a 16 ° C, 350 giri/min per 2 h. invertire la colonna delicatamente più volte ogni 30 min. Aprire la colonna di spin, posto in una nuova provetta di pulito da 1,5 mL e spin a 100 × g per 5 min a 4 ° C per raccogliere l’eluato. A secco (per esempio) 10% (v/v) del campione eluito (~ 25 µ l) in un evaporatore centrifugo e utilizzare per spettrometria di massa o altre ulteriori analisi. Aliquotare l’eluato rimanente (~ 275 µ l) diviso in undici centrifuga 1,5 mL provette (25 µ l ciascuna), a secco in un evaporatore centrifugo e conservare a-80 ° C. Analizzare i campioni conservati in tutta la procedura, nonché gli eluati da standard SDS-PAGE seguita da immunoblotting. Per la preparazione del campione, precipitato 50 µ g di totale (T), carico (L), flusso attraverso (FT), lavare 1 (W1) e 200 µ l di Wash 6 (W6) di cloroformio/metanolo estrazione16. Aggiungere 10 µ l di tampone di caricamento SDS-PAGE (tabella 1) per i campioni precipitati: 2x e 25 µ l di campione essiccato eluito. Vortice e far bollire per 10 minuti a 95 ° C in un blocco di calore. Analizzare totale (T), carico (L), flusso attraverso (FT), lavaggio 1 (W1), lavare 6 (W6) ed eluizione (E) immunoblotting usando gli anticorpi anti-TOC159 per determinare l’efficienza della procedura di isolamento.