Purification d’affinité des chloroplastes Translocon protéines Complexes à l’aide de la balise de robinet

1. préparation des plantes Arabidopsis Préparer 1 L de force la moitié du milieu de Murashige et Skoog (MS) moyen y compris vitamines contenant 1 % de sucrose et ajuster le pH à 5,7 avec l’hydroxyde de potassium (KOH). Ajouter 0,8 % du phytoagar et stériliser pendant 20 min à 120 ° C. Verser 75 mL de milieu MS par boîte de Petri (diamètre 14,5 cm, hauteur 3 cm) et de permettre la solidification pendant 1 h. Ajouter 30 mg de graines d’Arabidopsis thaliana à un tube de microtubes de 1,5 mL et surface de stériliser avec de l’éthanol 70 % (v/v) contenant 0,05 % (v/v) X-100 Triton pendant 5 min, suivie de 100 % (v/v) d’éthanol pendant 10 min. Retirez l’éthanol. Transférer les graines stérile papier filtre pour le séchage. Saupoudrer les graines stérilisées uniformément sur une plaque de MS (chaque génotype nécessite au moins 8 à 10 plaques) et sceller chaque plaque avec ruban chirurgical. Incuber les plaques à 4 ° C pendant deux jours dans l’obscurité pour synchroniser la germination des graines. Transfert vers une chambre de croissance avec le cycle de lumière suivant : 8 h de 120 µmol m−2 s−1 léger et 16 h d’obscurité à 22-20 ° C. 2. préparation de la HsIgG d’Agarose perles Suspendre le CNBr activés d’agarose perles (4 g) dans 100 mL d’HCl à 1 mM et incuber 30 min à température ambiante. Transférer les perles d’agarose dans un filtre en verre fritté, laver sous vide avec 100 mL d’HCl à 100 mM et répéter 2 – 3 fois.NOTE : Refroidir la solution de lavage à 4 ° C. Remettre en suspension l’agarose perles dans 1 mL de HCl à 100 mM froid et les transférer dans un tube à centrifuger conique 50 mL. Laver le filtre en verre fritté avec 3 mL de HCl à 100 mM et transférer le liquide dans le même tube. Tournant à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C et retirer le surnageant avec une pipette.Remarque : Ne pas décanter le tube. Remettre en suspension les perles dans 50 mL de tampon de couplage (tableau 1) ; mélanger brièvement et ensuite tourner à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C. Dissoudre 50 mg de l’Homo sapiens lyophilisée IgG (Hs-IgG) dans 10 mL de tampon de couplage, mélanger doucement les talons d’agarose et incuber dans un agitateur rotatif pendant une nuit à 4 ° C. Tournant à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C et retirer le surnageant avec une pipette. Laver les perles IgG-agarose avec 50 mL de couplage tampon et un essorage à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C. Remettre en suspension les perles IgG-agarose avec 50 mL de tampon de blocage (tableau 1) et un essorage à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C. Répéter une fois. Remettre en suspension les IgG-agarose perles dans 50 mL de tampon de blocage, tournez le mélange pendant 2 h à RT et un essorage à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C. Retirez le surnageant et remettre en suspension les IgG-agarose perles dans 200 mL de tampon de couplage de NaCl (tableau 1). Pour bloquer les groupes restants de CNBr réticulation, laver les perles IgG-agarose avec 100 mL de glycine-HCl 0,1 M pH 2,8. Tournant à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Laver avec 0,2 M glycine-HCl, pH 2,8, essorage à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Enfin, laver les perles IgG-agarose avec 200 mL d’eau ultrapure. Laver les perles IgG-agarose avec 200 mL d’eau ultrapure et ensuite 200 mL de tampon PBS (tableau 1). Remettre en suspension les IgG-agarose perles dans 20 mL de tampon PBS avec 0,01 % NaN3 (azoture de sodium) et de conserver à 4 ° C. 3. isolement et solubilisation de la Fraction de Membrane Broyer 10 g de semis a. thaliana âgé de trois semaines dans l’azote liquide en utilisant un froid mortier et un pilon avec du sable. Ajouter 20 mL de froid meulage tampon (tableau 1) à 10 g de tissu fondamental, bien mélanger et fondre sur la glace. Filtrer l’homogénat deux couches de matériau de filtration rapide dans un tube à centrifuger conique 50mL. Faire tremper le matériel de filtration rapide avec mouture tampon avant la filtration. Centrifuger le filtrat pendant 10 min à 1 500 × g à 4 ° C et transfert le surnageant dans un tube à centrifuger conique réfrigérés 50 mL, répétez la même étape une fois de plus et récupérer le surnageant. Conserver un échantillon de 200 µL de la « fraction totale » et conserver à-80 ° C pour une analyse ultérieure Transférer le surnageant à tubes ultracentrifugeuse mL 38,50 froide et garnir à 35 mL avec tampon de meulage froid. Centrifuger pendant 1 h à 100 000 × g à 4 ° C dans une ultracentrifugeuse. Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger conique 50 mL. Conserver un échantillon de 200 µL de la « fraction soluble » et les conserver à-80 ° C pour une analyse ultérieure. Resuspendre le culot vert en utilisant un homogénéisateur de téflon de verre, dans un tampon de meulage. Centrifuger pendant 1 h à 100 000 × g à 4 ° C dans une ultracentrifugeuse et éliminer le surnageant. Resuspendre le culot vert dans 18,75 mL 1 x tampon à l’aide d’un homogénéisateur de téflon verre de meulage et ajouter 9,375 mL 1 x tampon de meulage. Ajouter 9,375 mL de la solution de x solubilisation 4 (tableau 1) (contenant le détergent TX-100) pour donner 37,5 mL et incuber pendant 30 minutes sur un « agitateur rotatif » à 4 ° C. Centrifuger pendant 1 h à 100 000 × g à 4 ° C dans une ultracentrifugeuse. Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger conique 50 mL. Conserver un échantillon de 200 µL du surnageant (futur « fraction de charge ») et conserver à-80 ° C pour une analyse ultérieure. Resuspendre le culot dans 37,5 mL de tampon de meulage. Conserver l’échantillon de la partie insoluble et conserver à-80 ° C 4. immunoprécipitation Equilibrer les 100 µL de panier résine IgG-agarose en tampons A (tableau 1) et un essorage à 100 × g pendant 5 min à 4 ° C. Retirez le surnageant et remettre en suspension dans la résine IgG-agarose dans 100 µL de tampons A à 4 ° C. Transférer la résine IgG-agarose lavée à 37,5 mL des membranes solubilisées et incuber pendant la nuit sur un agitateur rotatif dans un tube à centrifuger conique 50 mL à 4 ° C. Sédiments l’IgG-agarose en résine à 100 × g pendant 5 min à 4 ° C et retirer le surnageant avec une pipette. Conserver un échantillon de 200 µL du flux « à travers » et conserver à-80 ° C pour une analyse ultérieure. Laver la résine IgG-agarose à 37,5 mL de tampons A et incuber pendant 10 min sur un agitateur rotatif. Sédiments la résine IgG-agarose à 100 × g pendant 5 min à 4 ° C, retirez le surnageant avec une pipette, ajouter 5 mL de broyage des tampons A dans un tube à centrifuger de 15 mL et centrifuger à 100 × g, 4 ° C, 5 min. conserver un échantillon de 200 µL du « Lavage 1 » et conserver à-80 ° C pour une analyse ultérieure. Répéter les 5 mL étape trois fois avec le tampon A. de lavage Effectuer les deux dernières étapes de lavage sans les inhibiteurs (NaF, inhibiteur de la protéase et PMSF)NOTE : Les inhibiteurs sont n’est plus nécessaire à ce stade et omis pour réduire les coûts. Conserver un échantillon de 200 µL du dernier lavage étape « lavage final (W6) » et conserver à-80 ° C pour une analyse ultérieure. Transférer la résine IgG-agarose à une colonne 500 µL avec un filtre à 35 µm et laver les perles deux fois avec 300 µL de tampon d’élution TEV (tableau 1) (ne contenant ne pas de AcTEV) pour l’équilibration. Fermer la colonne. Ajouter 300 µL de tampon d’élution TEV contenant 50 unités (10 µL) de l’AcTEV. Préparer le mélange dans un tube avant d’ajouter à la résine. Incuber la colonne avec des perles dans un thermomixer à 16 ° C, 350 tr/min pendant 2 h. la colonne inverser doucement plusieurs fois toutes les 30 minutes. Ouvrir la colonne, placez-le dans un nouveau tube propre 1,5 mL et un essorage à 100 × g pendant 5 min à 4 ° C à recueillir l’éluat. Sec (par exemple) 10 % (v/v) de l’échantillon éluée (~ 25 µL) dans un évaporateur centrifuge et utiliser pour la spectrométrie de masse ou autre une analyse plus approfondie. Aliquote l’éluat restant (~ 275 µL) divisé en onze centrifuger de 1,5 mL tubes (25 µL chaque), sécher dans un évaporateur centrifuge et conserver à-80 ° C. Analyse des échantillons conservés tout au long de la procédure ainsi que les éluats de norme SDS-PAGE suivie par immunoblotting. Pour la préparation de l’échantillon, précipité 50 µg de Total (T), charge (L), le débit à travers (FT), laver 1 (W1) et 200 µL de lavage 6 (W6) par chloroforme/méthanol extraction16. Ajouter 10 µL de 2 x tampon de charge de SDS-PAGE (tableau 1) pour les échantillons précipités et 25 µL de l’échantillon séché éluée. Vortex et faire bouillir pendant 10 min à 95 ° C dans un bloc chauffant. Analyse totale (T), charge (L), écoulement à travers (FT), lavage 1 (W1), laver 6 (W6) et élution (E) par immunotransfert utilisant des anticorps anti-TOC159 pour déterminer l’efficacité de la technique d’isolation.