Affinitätsreinigung der Chloroplasten Translocon Proteinkomplexe mit dem TAP-Tag

1. Vorbereitung von Arabidopsis-Pflanzen Bereiten Sie 1 L halbe Stärke Murashige und Skoog (MS) mittlere einschließlich Vitamine mit 1 % Saccharose und einstellen Sie des pH-Werts auf 5,7 mit Kalilauge (KOH). Hinzufügen von 0,8 % des Phytoagar und Autoklaven für 20 min bei 120 ° C. Gießen Sie 75 mL MS Medium pro Petri Platte (Durchmesser 14,5 cm, Höhe 3 cm) und lassen Sie die Erstarrung für 1 h. Ein 1,5 mL Microfuge Rohr 30 mg von Arabidopsis Thaliana Samen hinzu und Oberfläche Sterilisieren mit 70 % (V/V) Ethanol mit 0,05 % (V/V) Triton x-100 für 5 min, gefolgt von 100 % (V/V) Ethanol für 10 min. entfernen das Ethanol. Übertragen Sie die Samen, steriles Filterpapier zum trocknen. Streuen Sie die sterilisierten Samen gleichmäßig auf eine MS-Platte (jeder Genotyp erfordert mindestens 8 bis 10 Platten), und verschließen Sie jede Platte mit chirurgischen Klebeband. Zwei Tage in der Dunkelheit, Keimung der Samen zu synchronisieren inkubieren Sie die Platten bei 4 ° C. Transfer in eine Wachstums-Kammer mit folgenden Lichtzyklus: 8 h 120 µmol m−2 s−1 Licht und 16 h dunkel bei 22-20 ° C. 2. Vorbereitung der HsIgG Agarose Korne CNBr aktiviert Agarose Perlen (4 g) in 100 mL 1 mM HCl und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Übertragen Sie die Agarose-Perlen in einem gesinterten Glasfilter, waschen unter Vakuum mit 100 mL HCl 100 mM und 2 – 3 Mal wiederholen.Hinweis: Precool die Waschlösung bis 4 ° C. Aufschwemmen der Agarose Korne in 1 mL kalte 100 mM HCl und Übertragung auf einen konischen Zentrifugenröhrchen 50 mL. Waschen Sie der gesinterten Glasfilter mit 3 mL HCl 100 mM und übertragen Sie die Flüssigkeit auf das gleiche Rohr. Mit 400 × g für 5 min bei 4 ° C drehen Sie, und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette zu.Hinweis: Dekantieren Sie nicht das Röhrchen. Aufschwemmen der Perlen in 50 mL Kupplung Puffer (Tabelle 1); kurz mixen Sie und dann drehen Sie sich mit 400 × g für 5 min bei 4 ° C. 50 mg gefriergetrockneten Homo sapiens IgG (Hs-IgG) in 10 mL Kupplung Puffer auflösen, die Agarose Korne vorsichtig mischen und in rotary-Shaker über Nacht bei 4 ° c inkubieren Mit 400 × g für 5 min bei 4 ° C drehen Sie, und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette zu. Waschen Sie die IgG-Agarose Korne mit 50 mL Kupplung Puffer und Spin bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C. Aufschwemmen der IgG-Agarose-Beads mit 50 mL der blockierenden Puffer (Tabelle 1) und Spin bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C. Einmal wiederholen. Aufzuwirbeln Sie IgG-Agarose Korne in 50 mL blockierende Puffer, drehen Sie die Mischung für 2 h bei RT und Spin bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand zu entfernen und erneut die IgG-Agarose Korne in 200 mL NaCl Kupplung Puffer (Tabelle 1). Um alle restlichen Vernetzung CNBr Gruppen zu blockieren, waschen Sie die IgG-Agarose Korne mit 100 mL 0,1 M Glycin-HCl, pH 2,8. Mit 400 × g für 5 min bei 4 ° C drehen Sie, und entfernen Sie den Überstand zu. Waschen mit 0,2 M Glycin-HCl, pH 2,8, Spin bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C und den Überstand zu entfernen. Schließlich waschen Sie die IgG-Agarose Korne mit 200 mL Reinstwasser. Waschen Sie die IgG-Agarose Korne mit 200 mL Reinstwasser und dann 200 mL PBS-Puffer (Tabelle 1). Die IgG-Agarose Korne in 20 mL PBS-Puffer mit 0,01 % NaN3 (Natriumazid) Aufschwemmen und Lagerung bei 4 ° C. 3. Isolation und Solubilisierung der Membran-Fraktion Schleifen Sie 10 g drei Wochen alt A. Thaliana Sämlinge in flüssigem Stickstoff mit einem kalten Mörser und Stößel mit Sand. 20 mL kaltem Puffer (Tabelle 1), 10 g Boden Gewebe Schleifen hinzufügen, gut mischen und auf dem Eis auftauen. Filtern Sie das Homogenat durch zwei Schichten von schnellen Filtermaterial in einer konischen Zentrifugenröhrchen 50mL. Genießen Sie die schnelle Filtermaterial mit Schleifen Puffer vor der Filtration. Zentrifuge das Filtrat für 10 min bei 1500 × g bei 4 ° C und Übertragung der Überstand auf eine konische gekühlte 50 mL Zentrifugenröhrchen, wiederholen Sie das gleiche noch einmal Schritt und sammeln den überstand. Eine 200 µL Probe der “totalen Bruch” zu behalten und bei-80 ° C für eine spätere Analyse gespeichert Den Überstand an kalten 38,50 mL Ultrazentrifugen Röhren übertragen und top-bis zu 35 mL mit kalten Schleifen Puffer. Zentrifuge für 1 h bei 100.000 × g bei 4 ° C in einer Ultrazentrifuge. Übertragen Sie den Überstand auf eine 50 mL konische Zentrifugenröhrchen. Behalten Sie eine 200 µL Probe der “löslichen Fraktion” und laden bei-80 ° C für eine spätere Analyse. Wieder aussetzen Sie, die grünen Pellets mit einer Glas-Teflon-Homogenisator in Schleifen Puffer. Für 1 h bei 100.000 × g bei 4 ° C in einer Ultrazentrifuge zentrifugiert und den Überstand verwerfen. Aufschwemmen der grünen Pellet in 18,75 mL 1 x Schleifen Puffer mit einer Glas-Teflon-Homogenisator und 9,375 mL 1 x Schleifen Puffer. Fügen Sie 9,375 mL 4 X solubilisation Lösung (Tabelle 1) (mit dem TX-100 Reinigungsmittel hinzu), um 37,5 mL geben und 30 min auf eine “rotierende Shaker” bei 4 ° c inkubieren Zentrifuge für 1 h bei 100.000 × g bei 4 ° C in einer Ultrazentrifuge. Übertragen Sie den Überstand auf eine 50 mL konische Zentrifugenröhrchen. Behalten Sie eine 200 µL Probe des Überstandes (künftig “Last Bruch”) und Shop bei-80 ° C für eine spätere Analyse. Aufzuwirbeln Sie das Pellet in 37,5 mL Puffer Schleifen. Behalten Sie die Stichprobe von unlöslichen Teil und laden bei-80 ° C 4. Immunopräzipitation Equilibrate 100 µL der gepackten IgG-Agarose-Harz in Puffer A (Tabelle 1) und Spin 100 × g für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen der IgG-Agarose-Harz in 100 µL Puffer A bei 4 ° c Die gewaschene IgG-Agarose-Harz auf 37,5 mL solubilisiert Membranen übertragen und über Nacht auf einem rotierenden Shaker in ein 50 mL konische Zentrifugenröhrchen bei 4 ° c inkubieren Sediment der IgG-Agarose Harz bei 100 × g für 5 min bei 4 ° C und den Überstand mit einer Pipette zu entfernen. Behalten Sie eine 200 µL Probe der “Durchfluss” und bei-80 ° C für eine spätere Analyse gespeichert. Waschen Sie die IgG-Agarose-Harz in 37,5 mL Puffer A und inkubieren Sie für 10 min auf einem rotierenden Shaker. Sediment der IgG-Agarose-Harz bei 100 × g für 5 min bei 4 ° C, den Überstand mit einer Pipette entfernen, hinzufügen 5 mL Puffer A 15 mL Zentrifugenröhrchen, Zentrifuge bei 100 × g, 4 ° C, 5 min. Retain Schleifen eine 200 µL Probe der “Wash 1” und bei-80 ° C lagern für die spätere Analyse. Wiederholen Sie die 5 mL Schritt dreimal mit Puffer A. Waschen Führen Sie die beiden letzten Waschen ohne Inhibitoren (NaF, Protease-Inhibitor und PMSF)Hinweis: Inhibitoren sind nicht mehr erforderlich, in diesem Stadium und ausgelassen um Kosten zu reduzieren. Behalten Sie eine 200 µL Probe des letzten Waschen Schritt “endgültige Wash (W6)” und den Shop bei-80 ° C für eine spätere Analyse. Übertragen der IgG-Agarose-Harz auf einer 500 µL Spin Spalte mit einem 35 µm-Filter und die Perlen zweimal mit 300 µL der TEV Elution Buffer (Tabelle 1) (nicht mit entwicklelt) für Gleichgewichtherstellung zu waschen. Schließen Sie die Spin-Spalte. Fügen Sie 300 µL der TEV Elution Puffer mit 50 Einheiten (10 µL) entwicklelt. Bereiten Sie die Mischung in ein Rohr vor der Zugabe in das Harz. Die Spin-Spalte mit Perlen in einem Thermomixer bei 16 ° C inkubieren, 350 u/min für 2 h Invertieren der Spalte sanft mehrmals alle 30 Minuten. Öffnen Sie die Spin-Spalte zu, legen Sie sie in eine neue saubere 1,5 mL-Tube und Spin 100 × g für 5 min bei 4 ° C, das Eluat zu sammeln. Trocknen (zum Beispiel) 10 % (V/V) der eluierten Probe (~ 25 µL) in einem zentrifugalen Verdampfer und verwenden für Massenspektrometrie oder andere weitere Analyse. Aliquoten unterteilt die restlichen Eluat (~ 275 µL) in elf 1,5 mL Zentrifuge Röhren (25 µL), in eine zentrifugale Verdampfer trocknen und Lagern bei-80 ° C. Analysieren Sie die Proben während des Verfahrens sowie die Eluate von Standard Immunoblotting SDS-PAGE folgt einbehalten. Für die Probenvorbereitung, überstürzten 50 µg von insgesamt (T), Last (L), durch (FT), fließen waschen 1 (W1) und 200 µL Wash 6 (W6) durch Chloroform/Methanol-Extraktion-16. Fügen Sie 10 µL 2 x SDS-PAGE laden Puffer (Tabelle 1) zu den ausgefällten Proben und 25 µL eluierten getrockneten Probe. Wirbel und kochen für 10 min bei 95 ° C in einem Hitze-Block. Analysieren Sie insgesamt (T), Last (L), Durchströmung (FT), Wash 1 (W1), 6 (W6) und Elution (E) durch Immunoblotting mit Anti-TOC159 Antikörper um zu bestimmen, die Effizienz des Verfahrens Isolierung zu waschen.