זיקה טיהור של מתחמי חלבון Translocon כלורופלסט בעזרת התג ברז

1. הכנת הצמחים תודרנית להכנת 1 ליטר של חצי כוח של Murashige ו- Skoog (MS) ויטמינים כולל בינוני עם 1% סוכרוז ולהתאים את ה-pH ל 5.7 עם אשלגן הידרוקסידי (KOH). להוסיף 0.8% phytoagar והחיטוי במשך 20 דקות על 120 מעלות צלזיוס. יוצקים 75 מ ל MS בינוני לכל צלחת פטרי (קוטר 14.5 ס”מ, גובה 3 ס מ) ולאפשר את התמצקות לשעה. להוסיף 30 מ”ג של זרעים תודרנית לבנה צינור microfuge 1.5 mL, משטח לחטא עם אתנול 70% (v/v) המכילה 0.05% (v/v) טריטון X-100 במשך 5 דקות, ואחריו 100% אתנול (v/v) במשך 10 דקות להסיר את האתנול. להעביר את הזרעים נייר סינון סטרילי לייבוש. מפזרים את הזרעים סטיריליים באופן שווה על גבי צלחת MS (גנוטיפ לכל דורש לפחות 8-10 צלחות), חותם כל צלחת עם הדבקה. דגירה הלוחות ב 4 מעלות צלזיוס למשך יומיים בחושך כדי לסנכרן את נביטת הזרעים. העברה לתא צמיחה עם מחזור אור הבאים: 8 שעות של 120 µmol מ’−2 s− 1 אור, ו- h 16 של אפל ב 22-20 º C. 2. הכנת חרוזים HsIgG Agarose להשעות agarose ברומיד מופעל חרוזים (4 גרם) ב- 100 מ של 1 מ מ HCl, תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר את החרוזים agarose לתוך מסנן זכוכית sintered, לשטוף תחת ואקום עם 100 מ של 100 מ מ HCl וחזור על 2 – 3 פעמים.הערה: Precool הפתרון שטיפת 4 ° C. Resuspend את agarose חרוזים ב 1 מ”ל של קר 100 מ מ HCl ואת העברת שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ. שטוף את המסנן sintered זכוכית עם 3 מ ל 100 מ מ HCl, להעביר את הנוזל הצינור אותו. ספין-× 400 g עבור 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע עם פיפטה.הערה: לא decant את הצינור. Resuspend את החרוזים ב 50 מ של צימוד מאגר (טבלה 1); מערבבים בקצרה, ואז לסובב ב × 400 g למשך 5 דקות ב 4 º C. להמיס 50 מ”ג של הומו ספיינס lyophilized IgG (Hs-IgG) 10 מ”ל צימוד המאגר, לערבב בעדינות את החרוזים agarose, דגירה שייקר רוטרי בן לילה ב 4 º C. ספין-× 400 g עבור 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע עם פיפטה. לשטוף את החרוזים IgG-agarose עם 50 מ של צימוד מאגר ומסתובב ב × 400 g למשך 5 דקות ב 4 º C. Resuspend את החרוזים IgG-agarose עם 50 מ של מאגר חסימה (טבלה 1) ומסתובב ב × 400 g למשך 5 דקות ב 4 º C. חזור על פעם אחת. Resuspend איג-agarose חרוזים ב 50 מ של מאגר חסימה, לסובב את התערובת על 2 h ב- RT ו ספין-× 400 g עבור 5 דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע, resuspend את החרוזים IgG-agarose ב- 200 מ של NaCl צימוד מאגר (טבלה 1). כדי לחסום כל הקבוצות ברומיד cross-linking הנותרים, לשטוף את החרוזים IgG-agarose עם 100 מ של 0.1 M גליצין-HCl, pH 2.8. ספין-× 400 g עבור 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע. לשטוף עם 0.2 מ’ גליצין-HCl, pH 2.8, ספין-× 400 g עבור 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע. לבסוף, יש לשטוף את החרוזים IgG-agarose עם 200 מ של מים הנדסה גנטית. לשטוף את החרוזים IgG-agarose עם 200 מ של מים הנדסה גנטית, ולאחר מכן 200 מ ל מאגר PBS (טבלה 1). Resuspend את החרוזים IgG-agarose ב- 20 מ של PBS מאגר עם נאן 0.01%3 (אזיד הנתרן) ולאחסן ב 4 º C. 3. בידוד, Solubilization של השבר ממברנה לטחון 10 גרם של בן שלושה שבועות שתילים לבנה א בחנקן נוזלי באמצעות ומכתש קר עם חול. הוסף 20 מ של טחינת מאגר (טבלה 1) 10 גרם של רקמת הקרקע הקרה, מערבבים היטב, להפשיר על קרח. לסנן את homogenate באמצעות שתי שכבות של חומר סינון מהיר לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ. משרים את חומר סינון מהיר עם טחינת מאגר לפני הסינון. צנטריפוגה פילטרט של 10 דקות ב × 1,500 גרם 4 ° C, העברת תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה חרוט צוננת 50 מ ל, לחזור על אותו שלב פעם נוספת ולאסוף את תגובת שיקוע. שומרים על מדגם µL 200 של “השבר הכולל” ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס לניתוח בשלב מאוחר יותר להעביר את תגובת שיקוע mL 38.50 קר ultracentrifuge צינורות, טופ עד 35 מ עם מאגר שחיקה קר. צנטריפוגה עבור h 1 × 100,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס ultracentrifuge. להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ. שומרים על מדגם µL 200 של “שבר מסיסים”, חנות ב-80 מעלות צלזיוס לניתוח בשלב מאוחר יותר. מחדש להשעות בגדר ירוקים באמצעות מהמגן טפלון זכוכית, במאגר שחיקה. צנטריפוגה עבור h 1 × 100,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס ב ultracentrifuge ולמחוק את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר ירוק ב- 18.75 מ ל 1 x טחינת המאגר באמצעות מהמגן טפלון זכוכית ולהוסיף 9.375 מ ל 1 x טחינת מאגר. להוסיף מ 9.375 ל- 4 פתרון x solubilisation (טבלה 1) (מכיל הנוזל TX-100) לתת 37.5 מ ל, תקופת דגירה של 30 דקות על “מטרף מסתובב”-4 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה עבור h 1 × 100,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס ultracentrifuge. להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ. שומרים על מדגם 200 µL של תגובת שיקוע (העתיד “טען שבר”), חנות ב-80 מעלות צלזיוס לניתוח בשלב מאוחר יותר. Resuspend בגדר ב- 37.5 מ של שחיקה מאגר. שומרים על המדגם של חלק לא מסיסים וחנות ב-80 מעלות צלזיוס 4. Immunoprecipitation Equilibrate µL 100 של שרף IgG-agarose ארוזים במאגר A (טבלה 1) ומסתובב ב × 100 g למשך 5 דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע, resuspend שרף IgG-agarose ב µL 100 מאגר A-4 מעלות צלזיוס. להעביר את השרף IgG-agarose שטף mL 37.5 של ממברנות solubilized, דגירה בן לילה על מטרף מסתובבת בשפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ ל- 4 מעלות צלזיוס. משקעים IgG-agarose שרף ב × 100 g למשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע עם פיפטה. שומרים על מדגם µL 200 של הזרם”דרך” ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס לניתוח בשלב מאוחר יותר. רוחצים את השרף IgG-agarose ב- 37.5 מ של מאגר A את תקופת דגירה של 10 דקות על מטרף מסתובב. משקעים שרף IgG-agarose ב × 100 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, להסיר את תגובת שיקוע עם פיפטה הוסף 5 מ של שחיקה מאגר של שפופרת צנטריפוגה 15 מ”ל ו צנטריפוגה ב 100 × g, 4 ° C, 5 דק שמור מדגם µL 200 של”כביסה 1″, לאחסן ב- 80 ° C לניתוח בשלב מאוחר יותר. חזור על 5 mL שטיפה שלב שלוש פעמים עם מאגר א לבצע אחרונה שני השלבים כביסה בלי מעכבי (NaF, מעכבי פרוטאז ו- PMSF)הערה: מעכבי כבר לא נדרש בשלב זה, מושמט כדי להפחית את העלות. שומרים על מדגם 200 µL שעבר כביסה שלב “הסופי (W6)”רחיצת ואת החנות ב-80 מעלות צלזיוס לניתוח בשלב מאוחר יותר. להעביר את השרף IgG-agarose עמודה ספין 500 µL עם מסנן מיקרומטר 35 ולשטוף את החרוזים פעמיים עם 300 µL אס • תנאי מאגר (טבלה 1) (לא כולל AcTEV) עבור equilibration. סגור את העמודה ספין. להוסיף 300 µL אס • תנאי מאגר המכיל 50 יחידות (10 µL) של AcTEV. מכינים את תערובת צינור לפני הוספת השרף. דגירה העמודה ספין עם חרוזים ב thermomixer ב 16 ° C, 350 סל”ד עבור ה 2 היפוך העמודה בעדינות מספר פעמים בכל 30 דקות. פתח את העמודה ספין, מניחים אותה צינור נקי 1.5 mL החדש ומסתובב ב × 100 g למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף את eluate. יבש (למשל) 10% (v/v) מדגם eluted (~ 25 µL) במפזר צנטריפוגלי והשימוש ספקטרומטר מסה או אחרים ניתוח נוסף. Aliquot eluate הנותרים (~ 275 µL) מחולק ל 11 צנטריפוגה 1.5 mL צינורות (25 µL כל), נייבש המאייד צנטריפוגלי, ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס. לנתח את הדגימות נשמרים לאורך כל ההליך, כמו גם את eluates על ידי תקן מרחביות-דף ואחריו immunoblotting. בשביל הכנת הדוגמא, µg 50 precipitate של הכולל (T), עומס (L), הזרימה (FT), לשטוף 1 (W1) ו- µL 200 של שטיפת 6 (W6) על ידי מיצוי כלורופורם/מתנול16. להוסיף 10 µL של 2 x מרחביות-דף טעינת מאגר (טבלה 1) כדי הדגימות precipitated µL 25 eluted דגימת יבשים. מערבולת ומרתיחים במשך 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום. ניתוח הכולל (T), עומס (L), הזרימה (FT), שטיפת 1 (W1), לשטוף 6 (W6) • תנאי (E) על ידי immunoblotting באמצעות נוגדנים anti-TOC159 כדי לקבוע את היעילות של ההליך בידוד.