Purificação da afinidade do cloroplasto Translocon proteínas complexos usando a marca de torneira

1. preparação das plantas de Arabidopsis Preparar 1 L de metade da força de Murashige e Skoog (MS) médio incluindo vitaminas com 1% de sacarose e ajustar o pH a 5.7 com hidróxido de potássio (KOH). Adicionar 0,8% de phytoagar e autoclave por 20 min a 120 ° C. Despeje 75 mL de meio MS por placa de Petri (diâmetro de 14,5 cm, altura 3 cm) e permitir que a solidificação por 1h. Adicionar 30 mg de Arabidopsis thaliana sementes para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e superfície esterilizar com etanol a 70% (v/v) contendo 0,05% (v/v) Triton X-100 por 5 min, seguido por 100% de etanol (v/v) por 10 min. Retire o etanol. Transferi as sementes para o papel de filtro estéril para secar. Polvilhe as sementes esterilizadas uniformemente em uma placa de MS (cada genótipo requer placas de pelo menos 8-10) e cada placa com fita cirúrgica do selo. Incube as placas a 4 ° C durante dois dias no escuro para sincronizar a germinação das sementes. Transferência para uma câmara de crescimento com o seguinte ciclo de luz: 8 h de 120 µmol m− 2 s− 1 luz e 16 h de dark 22-20 ° c. 2. preparação dos grânulos de HsIgG Agarose Suspender contas de agarose ativada por CNBr (4 g) em 100 mL de HCl de 1 mM e incube por 30 min à temperatura ambiente. Transferir os grânulos de agarose em um filtro de vidro sinterizado, lavar sob vácuo com 100 mL de HCl a 100 mM e repita 2 – 3 vezes.Nota: Precool a solução de lavagem de 4 ° C. Ressuspender o grânulos de agarose em 1 mL de HCl frio de 100 milímetros e transferir para um tubo de centrifuga conico de 50 mL. Lavar o filtro de vidro sinterizado com 3 mL de HCl a 100 mM e transferir o líquido para o tubo mesmo. Girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante com uma pipeta.Nota: Não decante o tubo. Resuspenda as gotas em 50 mL de tampão de ligação (tabela 1); Misture rapidamente e então giram em 400 × g por 5 min a 4 ° C. Dissolver 50 mg de liofilizado Homo sapiens IgG (Hs-IgG) em 10 mL de tampão de ligação, misture-os delicadamente os grânulos de agarose e incubar em agitador rotativo durante a noite a 4 ° C. Girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante com uma pipeta. Lave os grânulos de IgG-agarose com 50 mL de acoplamento buffer e girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda os grânulos de IgG-agarose com 50 mL de tampão de bloqueio (tabela 1) e girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Repeti uma vez. Resuspenda IgG-agarose grânulos em 50 mL de tampão de bloqueio, gire a mistura por 2 h no RT e girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender os grânulos de IgG-agarose em 200 mL de tampão de ligação de NaCl (tabela 1). Para bloquear qualquer restantes grupos de CNBr do cross-linking, lave os grânulos de IgG-agarose com 100 mL de HCl glicina 0,1 M, pH 2.8. Girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. Lavar com 0,2 M glicina-HCl, pH 2.8, girar a 400 × g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. Finalmente, lave os grânulos de IgG-agarose com 200 mL de água ultrapura. Lave os grânulos de IgG-agarose com 200 mL de água ultrapura e, em seguida, 200 mL de tampão PBS (tabela 1). Resuspenda os grânulos de IgG-agarose em 20 mL de tampão PBS com 0.01% NaN3 (azida sódica) e armazenar a 4 ° C. 3. isolamento e solubilização da fração de membrana Moa 10 g de plântulas da . thaliana três semanas de idade em nitrogênio líquido, usando um pilão frio com areia. Adicionar 20 mL de frio retificadora Reserva (tabela 1) 10 g de tecido do chão, misture bem e descongele no gelo. Filtre o homogenate através de duas camadas de material de filtração rápida em um tubo de centrifuga conico de 50mL. Mergulhe o material de filtração rápida com moagem buffer antes da filtragem. Centrifugador do filtrado durante 10 minutos a 1.500 × g a 4 ° C e transferência o sobrenadante para um tubo de centrifuga conico 50ml refrigerados, repita o mesmo passo mais uma vez e recolher o sobrenadante. Uma amostra de 200 µ l da fração”total” de reter e armazenar a-80 ° C para posterior análise Transferir o sobrenadante para tubos de se frio 38,50 mL e superior a 35 mL com buffer moagem a frio. Centrífuga para 1h a 100.000 × g a 4 ° C em uma se. Transferi o sobrenadante para um tubo de centrifuga conico de 50 mL. Manter uma amostra de 200 µ l da “fração solúvel” e loja a-80 ° C para posterior análise. Ressuspender o pellet verde usando um homogeneizador de teflon de vidro, no buffer de moagem. Centrifugue durante 1 h a 100.000 × g a 4 ° C em um se e descartar o sobrenadante. Ressuspender o verde em 18,75 mL de 1x Buffer usando um homogeneizador de teflon vidro de moedura e adicionar 9,375 mL de 1x tampão de moagem. Adicionar 9,375 mL de solução de x solubilisation 4 (tabela 1) (contendo o detergente TX-100) para dar a 37,5 mL e incubar durante 30 min num “agitador rotativo” a 4 ° C. Centrífuga para 1h a 100.000 × g a 4 ° C em uma se. Transferi o sobrenadante para um tubo de centrifuga conico de 50 mL. Manter uma amostra de 200 µ l do sobrenadante (futuro “fração de carga”) e loja a-80 ° C para posterior análise. Resuspenda o pellet em 37,5 mL de tampão de moagem. Manter a amostra da parte insolúvel e loja a-80 ° C 4. imunoprecipitação Equilibrar a 100 µ l de resina embalada IgG-agarose no tampão A (tabela 1) e girar a 100 × g por 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender a resina de IgG-agarose em 100 µ l de tampão A 4 ° c. Transferir a resina de IgG-agarose lavada para a 37,5 mL de membranas solubilizadas e incubar durante uma noite num agitador rotativo em um tubo de centrifuga conico de 50 mL a 4 ° C. Sedimentos o IgG-agarose da resina em 100 × g por 5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante com uma pipeta. Manter uma amostra de 200 µ l da “fluir” e armazenar a-80 ° C para posterior análise. Lave a resina de IgG-agarose em 37,5 mL de tampão A e incubar durante 10 minutos num agitador rotativo. Sedimentos a resina de IgG-agarose em 100 × g por 5 min a 4 ° C, remover o sobrenadante com uma pipeta, adicionar 5 mL de moagem tampão A um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugar 100 × g, 4 ° C, 5 min. reter um 200 µ l da amostra da “Lavagem de 1” e armazenar a-80 ° C para uma análise posterior. Repetir os 5 mL passo três vezes com Buffer A. de lavagem Realizar as duas últimas etapas de lavagem sem os inibidores (NaF, inibidor de Protease e PMSF)Nota: Inibidores já não são necessários nesta fase e omitidos para reduzir o custo. Manter uma amostra de 200 µ l da última lavagem etapa “final lavagem (W6)” e loja a-80 ° C para posterior análise. Transferir a resina de IgG-agarose para uma coluna de rotação 500 µ l com um 35 µm filtro e lave os grânulos duas vezes com 300 µ l de tampão de eluição do PEV (tabela 1) (não contendo AcTEV) para o equilíbrio. Feche a coluna de rotação. Adicione 300 µ l de tampão de eluição de TEV contendo 50 unidades (10 µ l) de AcTEV. Prepare a mistura em um tubo antes de adicionar à resina. Incubar a coluna de rotação com grânulos em um thermomixer a 16 ° C, 350 rpm por 2 h. inverter a coluna suavemente várias vezes cada 30 min. Abra a coluna giro, colocá-lo em um novo tubo limpo 1,5 mL e a rotação em 100 × g por 5 min a 4 ° C, para recolher o eluato. Seca (por exemplo) 10% (v/v) da amostra eluted (~ 25 µ l) em um evaporador centrífugo e usar para espectrometria de massa ou outra uma análise mais aprofundada. Alíquota o eluato restante (~ 275 µ l) dividido em onze centrífuga 1,5 mL tubos (25 µ l cada), secar em um evaporador centrífugo e armazenar a-80 ° C. Analise as amostras mantidas durante todo o procedimento, bem como os eluídos pelo padrão de SDS-PAGE seguido immunoblotting. Para a preparação da amostra, precipitado de 50 µ g do Total (T), carga (L), fluxo (FT), lavar 1 (W1) e 200 µ l de lavagem 6 (W6) pela extração de clorofórmio/metanol16. Adicione 10 µ l de 2x do amortecedor do carregamento de SDS-PAGE (tabela 1) para as amostras precipitadas e 25 µ l de amostra seca eluted. Vórtice e ferver durante 10 minutos a 95 ° C, em um bloco de calor. Analisar Total (T), carga (L), fluxo (FT) através de lavagem 1 (W1), lavar 6 (W6) e eluição (E) pelo immunoblotting utilizando anticorpos anti-TOC159 para determinar a eficiência do processo de isolamento.