Sentez ve μ-Conotoxin PIIIA izomerler farklı disülfür Connectivities ile yapı belirlenmesi
Summary
Sistein-zengin peptidler onların disülfür bağlantısı bağlı olarak farklı üç boyutlu yapılar içine katlayın. Arabellek oksidasyon istenen disülfür bağlantı yol değil tek tek disülfit izomerler hedeflenen sentezi gereklidir. Protokol ile 3 disülfür bağ peptidler ve NMR ve MS/MS çalışmaları kullanarak onların yapısal analiz sentez seçici fırsatlar.
Abstract
Peptidler katıldı yüksek sayıda genellikle üç boyutlu yapısı ile ilgili olarak onların disülfür bağlantısı tarafından etkilenmiştir. Bu tamamen farklı peptid yapısında neden olabilir çünkü böylece istenmeyen disülfit bağı oluşumu sırasında peptid sentez, önlemek son derece önemlidir ve sonuç olarak bioactivity değişmiş. Ancak, birden çok disülfür bağları bir peptid içinde doğru oluşumu birkaç disülfür connectivities oluşturulması mümkündür çünkü geleneksel arabellek oksidasyon iletişim kuralları gibi standart kendi kendine katlama yöntemleri kullanarak elde etmek zordur. Bu iletişim kuralının gelişmiş bir strateji hangi arabellek oksidasyon yüksek kalite ve miktar üzerinden sentezlenmiş değil birden fazla disülfür köprü peptidler hedeflenen sentezi için gerekli temsil etmektedir. Çalışma uygulamasının bir stratejinin farklı koruma grubu µ-conotoxin PIIIA, tüm olası peptid 3 disülfür bağ izomerler sentezi için hedeflenen bir şekilde gösterir. Peptidler tanımlanmış disülfit bağı oluşumu için bir koruma grubu strateji kullanarak katı faz Fmoc tabanlı peptid sentez tarafından hazırlanır. Katıldı ilgili çift trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) ve tertile korunmaktadır-bütil (tBu) koruma grupları her oksidasyon adımı sırasında yalnızca gerekli katıldı deprotected bağlı ve emin olmak için. Hedeflenen sentez yanı sıra çeşitli analitik yöntemlerin bileşimini doğru katlanır ve istenen peptit yapılarının üretimi açıklamak için kullanılır. Farklı 3 disülfür bağ izomerler karşılaştırılması disülfür bağlantısı üç boyutlu yapısı hesaplanması için ve biyolojik yorumlanması için bilgi ve doğru belirlenmesi önemi gösterir peptid izomerler faaliyet. Analitik karakterizasyonu adapte bir iletişim kuralı tarafından üretilen sağlam peptid izomer kısmen azaltılmış ve alkylated türevleri ile gerçekleştirilen tandem kütle spektrometresi (MS/MS) analizi ile tam disülfür bağ aydınlatma içerir. Ayrıca, peptit yapılarının 2D nükleer manyetik rezonans (NMR) deneyleri ve MS/MS analizinden elde edilen bilgi kullanılarak belirlenir.
Introduction
Biyolojik hedefler1için güçlü ve çok seçici bileşikleri gösterdiğinden ilaç araştırma ve geliştirme biyoaktif peptidler kullanımı son derece kabul edilmektedir. Kendi bioactivity için ancak, üç boyutlu yapısı yapısı-faaliyet ilişki çalışmaları2,3,4gerçekleştirmek için büyük önem taşıyor. Genel uyum etkileyen birincil amino asit dizini dışında disülfür bağları önemli ölçüde sistein-zengin peptidler5yapısını stabilize. Birden çok disülfür köprü peptidler µ-PIIIA altı katıldı onun sırayla içeren Conus purpurascens üzerinden gibi conotoxins içerir. Bu yüksek sistein içerik teorik olarak 15 disülfür izomerler oluşumunu sağlar. Doğru disülfür bağlantı biyolojik aktivitesi6,7için çok önemlidir. Ancak, doğal olarak meydana gelen peptidler ve bu yüzden, bu izomerler hangisinin en yüksek biyolojik aktivitesi sahiptir Eğer birden fazla biyoaktif biçimi olup doğar soru nedir? Μ-conotoxins söz konusu olduğunda, biyolojik hedefler voltaj kapılı Sodyum iyon kanalları ve μ-PIIIA özellikle için alt NaV1.2, Na en güçlüV1.4 ve NaV1.73.
Disülfür köprü peptidler sentezi çeşitli yöntemler kullanılarak elde edilebilir. Disülfür bağları bir peptid içinde oluşumu için en uygun yöntem olarak adlandırılan oksidatif kendi kendine katlanır yaklaşımdır. Burada, istenen döngüsel peptid doğrusal habercisi ilk bölünme polimer destek oksidasyon bir tampon sistemi tabi sonra olan katı fazlı peptid sentez kullanarak sentezlenir. Redoks aktif ajanlar azaltılmış ve okside glutatyon (GSH/GSSG) gibi sık sık disülfür bağları oluşumu tanıtmak için eklenir. Arabellek desteklenen kendi kendine katlama ana dezavantajı disülfür bağları seçmeli olarak kademeli bir biçimde oluşturulur değil olmasıdır. Kendisi için çoğunlukla belirli tek disülfit izomer tanımlanır, yerel peptid için karşılaştırıldığında bu yaklaşım8ile çok sayıda izomerler elde etmek mümkündür. Μ-PIIIA zaten bir önceki çalışmada3‘ te kendi kendine katlanır üzerine en az üç farklı şekilde katlanmış izomerler neden olduğu gösterilmiştir. Böyle bir izomer karışımı ayrılması kromatografik arıtma yöntemleri9kullanıyorsanız benzer saklama kez nedeniyle oldukça zordur. Belirli bir izomer hedeflenen sentezi bu nedenle avantajlıdır. Özellikle hangi disülfür bağları bir izomer ile tanımlanmış disülfür connectivity, özel bir strateji gerekli üretmek için sırayla kapalı. Bu nedenle, farklı koruma grupları bireysel sistein çiftleri taşıyan doğrusal habercisi polimer destek sentezlenir. Eleme sonra sistein çiftleri ayrı ayrı ve sırayla deprotected ve istenen disülfür bağları10,11,12,13, vermeye bir oksidasyon reaksiyonu bağlı 14 , 15 , 16. bir sentez ve reaksiyon ürünü arıtma sonra bu kimliği ve disülfür bağlantı onaylamak için uygun analitik yöntemler tarafından gerekli. Çok sayıda analitik yöntemleri birincil amino asit dizisi, e.gaydınlatma için kullanılabilir., MS/MS, disülfür bağlantı belirlenmesi hala daha az incelenen kalırken. Böyle birden çok disülfür bağ peptidler, ürünle ilgili yabancı maddelerin karmaşıklığı dışında (Örneğin., disülfür çabalıyorlar üzerinden), örnek nedeniyle hazırlık ve iş-up daha fazla analiz karmaşık hale getirebilir. Bu yazıda, farklı analitik teknikleri bir arada kullanımı tümden µ-PIIIA izomerler disülfür bağları kimliğini açıklamak için gerekli olduğunu göstereceğiz. Biz kromatografik yöntemler kütle spektrometresi ile kombine ve NMR spektroskopisi için aynı örnekleri verilmektedir. Matris yardımlı lazer desorption/ionization(MALDI) MS/MS analiz, biz yukarıdan aşağıya doğru analiz için bu peptid mümkün değildir çünkü kısmi azaltma ve iodoacetamide derivatization kullanarak disülfür bağları tespit. 2D NMR deneyler her izomer üç boyutlu yapısını elde etmek için yapıldı. Böylece, farklı karmaşık analitik yöntemleri birleştirerek, bu düzgün disülfür bağlantı ve karmaşık üç boyutlu yapısı birden çok disülfür bağ peptidler7aydınlatmak mümkündür.
Protocol
Representative Results
Discussion
Μ-PIIIA seçerek disülfür bağ izomerler aynı amino asit dizisi üzerinden üretmek için bir olasılık temsil eder gibi sistein-zengin peptidler sentezi için burada açıklanan yöntemi. Bu nedenle, Fmoc tabanlı düz gibi yöntemleri peptid sentez18 faz ve disülfür bağları regioselective oluşumu için tanımlanmış bir koruma grubu strateji edildi kullanılan16kurdu. Katı faz peptid sentez otomatik sentezi ile polimer destek (reçine) amino asit dizileri üre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A. Resemann, F. J. Mayer ve ö. Suckau Bruker Daltonics GmbH Bremen dan teşekkür etmek istiyorum; Ö Tietze, A. A. Tietze, V. Schmidts ve C. Thiele Darmstadt Teknoloji Üniversitesi üzerinden; FLI Jena, M. Engeser Bonn Üniversitesi üzerinden O. Ohlenschläger; K. Kramer, A. Harzen ve H. Nakagami dan bitki ıslahı araştırmaları, Köln Max Planck Enstitüsü; Susanne Neupert Zooloji, Köln Enstitüsü’nden; ve biyomoleküler manyetik rezonans spektroskopi Frankfurt Üniversitesi için imkanlar teknik desteği, modüller, eğitim ve aletleri için erişim. University of Bonn için Dedektif tarafından mali destek minnetle kabul edilmektedir.
Materials
| Fmoc Rink amide resin | Novabiochem | 855001 | |
| Pyr(Boc) | Bachem | A-3850 | |
| Arg(Pbf) | Iris Biotech | FSC1010 | |
| Asn(Trt) | Bachem | B-1785 | |
| Asp(tBu) | Iris Biotech | FSP1020 | |
| Hyp(tBu) | Iris Biotech | FAA1627 | |
| Lys(Boc) | Bachem | B-1080 | |
| Ser(tBu) | Iris Biotech | FSC1190 | |
| Gln(Trt) | Iris Biotech | FSC1043 | |
| Glu(tBu) | Iris Biotech | FSP1045 | |
| Trp(Boc) | Iris Biotech | FSC1225 | |
| Tyr(tBu) | Sigma Aldrich | 47623 | |
| Thr(tBu) | Iris Biotech | FSP1210 | |
| His(Trt) | Iris Biotech | FDP1200 | |
| 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat | Sigma Aldrich | 8510060 | Flammable |
| DMF | Fisher Scientific | D119 | Flammable, Toxic |
| DCM | Fisher Scientific | D37 | Carcinogenic |
| Piperidine | Alfa Aesar | A12442 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| N-Methyl-Morpholin | Sigma Aldrich | 224286 | |
| Cys(Acm) | Iris Biotech | FAA1506 | |
| Cys(Trt) | Bachem | E-2495 | |
| Cys(tBu) | Bachem | B-1220 | |
| trifluoruacetic acid | Sigma Aldrich | 74564 | Toxic, Corrosive |
| phenol | Merck | 1002060 | Toxic |
| thioanisol | Alfa Aesar | A14846 | |
| ethanedithiol | Fluka Analytical | 2390 | |
| diethyl ether | VWR | 100,921 | Flammable |
| tert-butanol | Alfa Aesar | L12338 | Flammable |
| acetonitrile | Fisher Scientific | A998 | Flammable |
| water | Fisher Scientific | W5 | |
| isopropanol | VWR | ACRO42383 | Flammable |
| sodium hydroxide | AppliChem | A6579,1000 | Corrosive |
| iodoacetamide | Sigma Aldrich | I6125 | |
| iodine | Sigma Aldrich | I0385 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 110165 | Corrosive |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| diphenylsulfoxide | Sigma Aldrich | P35405 | |
| anisol | Sigma Aldrich | 96109 | Flammable |
| trichloromethylsilane | Sigma Aldrich | M85301 | Flammable |
| sample dilution buffer | Laborservice Onken | ||
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 106370 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 795410 | |
| (2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| citric acid | Sigma Aldrich | 251275 | |
| sodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | W302600 | |
| tris-acetate | Carl Roth, | 7125 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E26282 | |
| peptide calibration standard II | Bruker Daltonics GmbH | 8222570 | |
| Name of Equipment | Company | ||
| solid-phase peptide synthesizer | Intavis Bioanalytical Instruments AG | EPS 221 | |
| lyophilizer | Martin Christ GmbH | Alpha 1-2 Ldplus | |
| semipreparative HPLC | Jasco | system PV-987 | |
| Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) | Knauer | 25QE181E2J | purification of the linear peptide |
| Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP1022 | purification of the oxidized peptide |
| analytical HPLC | Shimadzu | system LC-20AD | |
| Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP54 | analytical column |
| ground steel target (MTP 384) | Bruker Daltonics GmbH | NC0910436 | MALDI preparation |
| C18-concentration filter (ZipTip) | Merck KGaA | ZTC18S096 | MALDI preparation |
| MALDI mass spectrometer | Bruker Daltonics GmbH | ultraflex III TOF/TOF | |
| amino acid analyzer | Eppendorf-Biotronik GmbH | LC 3000 system | |
| NMR spectrometer Bruker Avance III | Bruker Daltonics GmbH | Bruker Avance III 600 MHz | |
| computer program for molecular visualising | YASARA Biosciences GmbH | Yasara structures | NMR structure calculation |
| computer program for MALDI data evaluation | Bruker Daltonics GmbH | flexAnalysis, BioTools | MS/MS fragmentation |
| analog vortex mixer | VWR | VM 3000 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5410 | |
| Centrifuge | Hettich | EBA 20 | |
| Rotational vacuum concentrator | Christ | 2-18 Cdplus | |
| Analytical Balance | A&D Instruments | GR-202-EC |
References
- Fosgerau, K., Hoffmann, T. Peptide therapeutics: Current status and future directions. Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).
- Gongora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
- Tietze, A. A., et al. Structurally diverse µ-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4. Angewandte Chemie – International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).
- Carstens, B. B., et al. Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich α-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif. Angewandte Chemie – International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).
- Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide. Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).
- Nielsen, K. J., et al. Solution structure of µ-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).
- Heimer, P., et al. Conformational µ-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation. Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).
- Chang, J. Y. Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models. Biochemistry. 50 (17), 3414-3431 (2011).
- Böhm, M., et al. Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).
- Postma, T. M., Albericio, F. Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis. European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).
- Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. Amino Acid-Protecting Groups. Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).
- Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. Disulfide bond formation in peptides. Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).
- Kamber, B., et al. The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides. Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).
- Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins. Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).
- Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation. Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).
- Peigneur, S., et al. δ-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity. Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).
- Heimer, P., et al. Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides. ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).
- Kates, S. A., Albericio, F. . Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , (2000).
- Wüthrich, K. NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture). Angewandte Chemie – International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).
