Синтез и определение структуры изомеров PIIIA µ-Conotoxin с различными дисульфида связность

Использование биоактивные пептиды в фармацевтических исследований и разработок является признанным, потому что они представляют собой мощный и высокоселективных соединений для конкретных биологических цели¹. Для их биологическую однако, трехмерная структура имеет большое значение для того, чтобы выполнять структура активность отношения исследования^2,3,4. Помимо первичного аминокислотной последовательности, которая влияет на общую конформации дисульфидными облигаций значительно стабилизации структуры хвоща богатые пептиды⁵. Несколько мост дисульфидных пептиды включают конотоксины например µ-PIIIA от конус скворец , который содержит шесть которым в своей последовательности. Это высокий хвоща содержимое теоретически позволяет формирование 15 дисульфида изомеров. Правильные дисульфида подключения является очень важным для биологической активности^6,7. Однако возникает вопрос есть ли более чем одной биоактивные конформации естественных пептидов и если да, какие из этих изомеров обладает высокой биологической активностью? В случае µ конотоксины, биологической цели являются воротами напряжения натрия ионных каналов, и µ-PIIIA, в частности, является самым мощным для подтипов_V1.2, Na Na Na_V1.7 и_V1.4³.

Синтез пептидов, дисульфид мост может быть достигнуто с помощью различных методов. Наиболее удобный способ для образования дисульфидных связей внутри пептид является так называемого оксидативного самостоятельно складной подход. Здесь линейная прекурсора желаемый циклические пептиды синтезируется, сначала с помощью твердофазный пептидного синтеза, который после расщепления от полимерных поддержки подвергается окислению в буферную систему. Редокс активных агентов, таких как восстановленного и окисленного глутатиона (GSH/GSSG) часто добавляются для поощрения образования дисульфидных связей. Основным недостатком буфер поддерживается собственной складывания является, что дисульфидными облигаций формируются в ступенчатой моды не выборочно. По сравнению с родной пептид, для которого часто описывается только один конкретный дисульфида изомер, это можно получить многочисленные другие изомеры с этот подход⁸. Уже было показано, что мкг-PIIIA привести к по крайней мере три по-разному сложенном изомеров после индивидуальной складывающиеся в предыдущем исследовании³. Разделение такой смеси изомером является довольно трудно из-за аналогичные удержания раз, если с помощью хроматографических очистки методы⁹. Поэтому выгодно целевых синтез определенных изомеров. Производить специально требуемого изомер с определенными дисульфида связи, специальной стратегии в котором дисульфидными облигаций последовательно закрываются. Таким образом линейной прекурсоров, перевозящих отдельные группы защиты в отдельных хвоща пар синтезируется на поддержку полимера. После ликвидации хвоща пары являются индивидуально и последовательно deprotected и связаны в реакции окисления приносить желаемых дисульфидными облигаций^{10,11,12,13, 14 , 15 , 16}. после синтеза и очистки продукта реакции, он требуется для подтверждения личности и соединения дисульфида подходящих методов анализа. Многочисленные аналитические методы доступны для выяснения основной аминокислотной последовательности, например., МС/МС, в то время как определение дисульфида подключения по-прежнему остается гораздо менее исследованы. Помимо сложности таких несколько дисульфида стружечные пептиды, связанные с продуктом примеси (например., от дисульфида скремблирования), из-за образец подготовки и работы могут еще более усложнить анализ. В этом документе мы покажем, что использование сочетания различных аналитических методов необходимо недвусмысленно разъяснить удостоверение дисульфидных связей в изомеров µ-PIIIA. Мы есть комбинированные методы хроматографии с масс-спектрометрии и же образцы для ЯМР спектроскопии. В desorption/ionization(MALDI) при содействии матрицы лазерный анализ МС/МС мы определили дисульфидными облигаций с помощью частичного сокращения и iodoacetamide деривации, потому что сверху вниз анализ не является возможным для этого пептида. Для того чтобы получить трехмерную структуру каждого изомера были эксперименты 2D ЯМР. Таким образом путем объединения различных сложных аналитических методов, это возможно для выяснения должным образом дисульфида подключения и трехмерной структуры комплекса несколько дисульфида стружечные пептиды⁷.