التوليف وتصميم هيكل الايزومرات بييا μ-كونوتوكسين مع Connectivities ثنائي كبريتيد مختلفة
Summary
إضعاف الببتيدات سيستين الغنية في هياكل ثلاثية الأبعاد مميزة اعتماداً على اتصال ثنائي كبريتيد. مطلوب توليف المستهدفة من ايزومرات ثنائي كبريتيد الفردية عند أكسدة العازلة لا يؤدي إلى اتصال ثنائي كبريتيد المرجوة. ويتناول البروتوكول التوليف انتقائية من الببتيدات 3-ثنائي كبريتيد المستعبدين والتحليل الهيكلي استخدام دراسات الرنين المغناطيسي النووي و MS/MS.
Abstract
عادة ما تتأثر الببتيدات مع عدد كبير من سيستينيس فيما يتعلق بهيكل ثلاثي الأبعاد باتصال ثنائي كبريتيد بهم. أنه هكذا هو بالغ الأهمية لتجنب تشكيل السندات ثنائي كبريتيد غير مرغوب فيها أثناء التوليف الببتيد، لأن ذلك قد يؤدي في بنية ببتيد مختلفة تماما، ونتيجة لذلك تعديل بيواكتيفيتي. غير الصحيح تشكيل السندات ثنائي كبريتيد متعددة في ببتيد يصعب الحصول عليها باستخدام أساليب ذاتية قابلة للطي القياسية مثل بروتوكولات أكسدة العازلة التقليدية، لأنه يمكن أن تشكل عدة ثنائي كبريتيد connectivities. ويمثل هذا البروتوكول استراتيجية متقدمة اللازمة لتركيب الببتيدات سد ثنائي كبريتيد المتعددة التي لا يمكن تجميعها عن طريق الأكسدة العازلة عالية الجودة والكمية المستهدفة. الدراسة يوضح تطبيق استراتيجية مجموعة حماية متميزة لتوليف جميع ايزومرات الببتيد ممكن 3-ثنائي كبريتيد المستعبدين بييا μ-كونوتوكسين بطريقة هادفة. الببتيدات يعدها توليف الببتيد المرحلة الصلبة المستندة إلى معتدلاً باستخدام استراتيجية مجموعة حماية لتشكيل ثنائي كبريتيد تعريف السندات. محمية أزواج كل منها من سيستينيس مع تريتيل (حزب تاي راك تاي)، أسيتاميدوميثيل (الأسبستوس) و ثالثي-بوتيل (تيبو) حماية المجموعات للتأكد من أن ديبروتيكتيد ومرتبطة فقط حاجة سيستينيس خلال كل خطوة الأكسدة. بالإضافة إلى توليف المستهدفة، يستخدم مزيجاً من عدة أساليب تحليلية لتوضيح الصحيح للطي وإنشاء هياكل الببتيد المرجوة. المقارنة بين الايزومرات المستعبدين من ثنائي كبريتيد 3 مختلفة تشير إلى أهمية تحديد دقيق والمعرفة باتصال ثنائي كبريتيد لحساب هيكل ثلاثي الأبعاد وتفسير البيولوجية النشاط ايزومرات الببتيد. ويشمل وصف تحليلي استجلاء هذه السندات ثنائي كبريتيد الدقيق عن طريق تحليل الطيف الكتلي (MS/MS) جنبا إلى جنب التي تتم مع مشتقات جزئيا انخفاض ويؤلكل أيسومر الببتيد سليمة تنتجها بروتوكولا تكييف. وعلاوة على ذلك، يتم تحديد هياكل الببتيد استخدام 2D الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) التجارب والمعارف التي تم الحصول عليها من تحليل MS/MS.
Introduction
استخدام الببتيدات النشطة بيولوجيا في البحوث الصيدلانية والتنمية هو تقديراً كبيرا، لأنها تمثل مركبات قوية وانتقائية للغاية لأهداف بيولوجية محددة1. لما بيواكتيفيتي، هيكل ثلاثي الأبعاد غير ذات أهمية كبيرة من أجل تنفيذ الهيكل والنشاط العلاقة دراسات2،،من34. وبصرف النظر عن تسلسل الأحماض الأمينية الأساسية التي تؤثر على تكيف عموما، استقرار السندات ثنائي كبريتيد إلى حد كبير هيكل الببتيدات الغنية سيستين5. وتشمل متعددة الببتيدات سد ثنائي كبريتيد والكونوتوكسين استيفاء مثل μ-بييا من أرجواني كونوس الذي يحتوي على ستة سيستينيس التسلسل. ويسمح هذا المحتوى سيستين عالية نظرياً تشكيل 15 ثنائي كبريتيد الايزومرات. اتصال ثنائي كبريتيد الصحيحة مهم جداً لأن النشاط البيولوجي6،7. بيد أن السؤال الذي يطرح نفسه ما إذا كان هناك أكثر من تكيف النشطة بيولوجيا الببتيدات التي تحدث بشكل طبيعي، وإذا كان ذلك، الذي هذه الايزومرات يمتلك النشاط البيولوجي أعلى؟ وفي حالة μ-والكونوتوكسين استيفاء، الأهداف البيولوجية بقنوات أيون الصوديوم عن طريق بوابة الجهد، و μ-بييا على وجه الخصوص أقوى للأنواع الفرعية ناV1.2، ناV1.4 و NaV1.73.
يمكن تركيب الببتيدات سد ثنائي كبريتيد باستخدام أساليب مختلفة. الأسلوب الأكثر ملاءمة لتشكيل ثنائي كبريتيد السندات داخل ببتيد هو ما يسمى بالنهج الذاتي للطي الأكسدة. هنا، يتم تصنيعه السلائف الخطي من الببتيد دوري المطلوب أولاً باستخدام الببتيد الصلبة-مرحلة التوليف، بعد انشقاق من دعم البوليمرية يتعرض للأكسدة في نظام المخزن مؤقت. غالباً ما يتم إضافة عوامل الأكسدة النشطة مثل انخفاض والمؤكسدة الجلوتاثيون (المدفع جريازيف/جسج) تشجيع تشكيل روابط ثنائي كبريتيد. والعيب الرئيسي في دعم المخزن المؤقت الذاتي قابلة للطي أن السندات ثنائي كبريتيد تتشكل ليس انتقائيا بشكل تدريجي. الببتيد الأصلية، التي غالباً ما يوصف ايزومير ثنائي كبريتيد محدد واحد فقط، بالمقارنة مع الممكن الحصول على العديد من الايزومرات الأخرى مع هذا النهج8. وقد أثبت بالفعل μ-بييا أن يؤدي على الأقل ثلاثة ايزومرات مطوية بشكل مختلف عند طي ذاتيا في دراسة سابقة3. بدلاً من ذلك صعباً نتيجة مماثلة مرات الاحتفاظ بفصل هذه أن خليط ايزومير إذا استخدام أساليب تنقية الكروماتوغرافي9. ولذلك توليف ايزومير محددة مستهدفة مفيد. لإنتاج على وجه التحديد أيسومر مع اتصال ثنائي كبريتيد محددة، استراتيجية خاصة مطلوب في فيها سندات ثنائي كبريتيد تباعا مغلقة. ولذلك، يتم تصنيعه السلائف خطية تحمل مجموعات حماية متميزة في أزواج سيستين الفردية في دعم البوليمر. بعد القضاء على، أزواج سيستين فردياً وتباعا ديبروتيكتيد وترتبط بفعل أكسدة لإنتاج ثنائي كبريتيد المطلوب سندات10،11،،من1213، 14 , 15 , 16-بعد التوليف وتنقية المنتج رد فعل، أنه مطلوب لتأكيد الهوية والاتصال ثنائي كبريتيد بالطرق التحليلية المناسبة. وتتوفر العديد من الأساليب التحليلية لتوضيح تسلسل الأحماض الأمينية الأساسية، على سبيل المثال-، MS/MS، حين تحديد اتصال ثنائي كبريتيد لا يزال أقل بكثير من التحقيق. وبصرف النظر عن الطابع المعقد لهذه الببتيدات المستعبدين من ثنائي كبريتيد متعددة، الشوائب المتعلقة بالمنتج (على سبيل المثال.، من ثنائي كبريتيد الهرولة)، نظراً لنموذج إعداد ومتابعة أعمال يمكن أن تزيد من تعقيد التحليل. في هذه الورقة، ونحن تبين أن استخدام مزيج من التقنيات التحليلية المختلفة اللازمة لتوضيح هوية السندات ثنائي كبريتيد في ايزومرات μ-بييا لا لبس فيه. لدينا طرق الكروماتوغرافي جنبا إلى جنب مع الطيف الكتلي وقدمت نفس العينات للتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي النووي. وفي desorption/ionization(MALDI) الليزر ساعد مصفوفة تحليل MS/MS، حددنا السندات ثنائي كبريتيد باستخدام الحد الجزئي و derivatization إيودواسيتاميدي لأنه ليس من الممكن لهذا الببتيد التحليل من أعلى إلى أسفل. 2D الرنين المغناطيسي النووي تجارب أجريت من أجل الحصول على هيكل ثلاثي الأبعاد لكل أيزومر. وهكذا، عن طريق الجمع بين أساليب تحليلية متطورة متميزة، فمن الممكن توضيح بشكل صحيح اتصال ثنائي كبريتيد وبنية ثلاثية الأبعاد معقدة متعددة الببتيدات المستعبدين من ثنائي كبريتيد7.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة الموضحة هنا لتركيب الببتيدات سيستين الغنية مثل بيييا μ يمثل إمكانية لإنتاج ايزومرات ثنائي كبريتيد المستعبدين من نفس تسلسل الأحماض الأمينية بشكل انتقائي. ولذلك، أنشأت أساليب مثل الصلبة المستندة إلى معتدلاً المرحلة الببتيد التوليف18 واستراتيجية مجموعة حماية محددة لت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر ريسمان ألف وواو ياء ماير سوكو دال من بروكر دالتونيكس GmbH بريمن؛ دال تيتزي، تيتزي ألف ألف، شميدتس ف وتييلي جيم من جامعة دارمشتات للتكنولوجيا؛ Ohlenschläger سين من يينا FLI، م. انجيسير من جامعة بون؛ كرامر ك. وألف هارزين H. ناكاجامي من معهد ماكس بلانك لبحوث تربية النبات، كولونيا؛ سوزان نوبيرت من معهد علم الحيوان، كولونيا؛ ومرافق التحليل الطيفي الرنين المغناطيسي الجزيئية البيولوجية من جامعة فرانكفورت للتقنية الدعم والتدريب الوحدات النمطية، والوصول إلى الأدوات. هو العرفان بالدعم المالي المقدم من جامعة بون إلى D.I..
Materials
| Fmoc Rink amide resin | Novabiochem | 855001 | |
| Pyr(Boc) | Bachem | A-3850 | |
| Arg(Pbf) | Iris Biotech | FSC1010 | |
| Asn(Trt) | Bachem | B-1785 | |
| Asp(tBu) | Iris Biotech | FSP1020 | |
| Hyp(tBu) | Iris Biotech | FAA1627 | |
| Lys(Boc) | Bachem | B-1080 | |
| Ser(tBu) | Iris Biotech | FSC1190 | |
| Gln(Trt) | Iris Biotech | FSC1043 | |
| Glu(tBu) | Iris Biotech | FSP1045 | |
| Trp(Boc) | Iris Biotech | FSC1225 | |
| Tyr(tBu) | Sigma Aldrich | 47623 | |
| Thr(tBu) | Iris Biotech | FSP1210 | |
| His(Trt) | Iris Biotech | FDP1200 | |
| 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat | Sigma Aldrich | 8510060 | Flammable |
| DMF | Fisher Scientific | D119 | Flammable, Toxic |
| DCM | Fisher Scientific | D37 | Carcinogenic |
| Piperidine | Alfa Aesar | A12442 | Flammable, Toxic, Corrosive |
| N-Methyl-Morpholin | Sigma Aldrich | 224286 | |
| Cys(Acm) | Iris Biotech | FAA1506 | |
| Cys(Trt) | Bachem | E-2495 | |
| Cys(tBu) | Bachem | B-1220 | |
| trifluoruacetic acid | Sigma Aldrich | 74564 | Toxic, Corrosive |
| phenol | Merck | 1002060 | Toxic |
| thioanisol | Alfa Aesar | A14846 | |
| ethanedithiol | Fluka Analytical | 2390 | |
| diethyl ether | VWR | 100,921 | Flammable |
| tert-butanol | Alfa Aesar | L12338 | Flammable |
| acetonitrile | Fisher Scientific | A998 | Flammable |
| water | Fisher Scientific | W5 | |
| isopropanol | VWR | ACRO42383 | Flammable |
| sodium hydroxide | AppliChem | A6579,1000 | Corrosive |
| iodoacetamide | Sigma Aldrich | I6125 | |
| iodine | Sigma Aldrich | I0385 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 110165 | Corrosive |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| diphenylsulfoxide | Sigma Aldrich | P35405 | |
| anisol | Sigma Aldrich | 96109 | Flammable |
| trichloromethylsilane | Sigma Aldrich | M85301 | Flammable |
| sample dilution buffer | Laborservice Onken | ||
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 106370 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | 795410 | |
| (2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | |
| citric acid | Sigma Aldrich | 251275 | |
| sodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | W302600 | |
| tris-acetate | Carl Roth, | 7125 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E26282 | |
| peptide calibration standard II | Bruker Daltonics GmbH | 8222570 | |
| Name of Equipment | Company | ||
| solid-phase peptide synthesizer | Intavis Bioanalytical Instruments AG | EPS 221 | |
| lyophilizer | Martin Christ GmbH | Alpha 1-2 Ldplus | |
| semipreparative HPLC | Jasco | system PV-987 | |
| Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) | Knauer | 25QE181E2J | purification of the linear peptide |
| Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP1022 | purification of the oxidized peptide |
| analytical HPLC | Shimadzu | system LC-20AD | |
| Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm) | Hichrom-VWR | HICH218TP54 | analytical column |
| ground steel target (MTP 384) | Bruker Daltonics GmbH | NC0910436 | MALDI preparation |
| C18-concentration filter (ZipTip) | Merck KGaA | ZTC18S096 | MALDI preparation |
| MALDI mass spectrometer | Bruker Daltonics GmbH | ultraflex III TOF/TOF | |
| amino acid analyzer | Eppendorf-Biotronik GmbH | LC 3000 system | |
| NMR spectrometer Bruker Avance III | Bruker Daltonics GmbH | Bruker Avance III 600 MHz | |
| computer program for molecular visualising | YASARA Biosciences GmbH | Yasara structures | NMR structure calculation |
| computer program for MALDI data evaluation | Bruker Daltonics GmbH | flexAnalysis, BioTools | MS/MS fragmentation |
| analog vortex mixer | VWR | VM 3000 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5410 | |
| Centrifuge | Hettich | EBA 20 | |
| Rotational vacuum concentrator | Christ | 2-18 Cdplus | |
| Analytical Balance | A&D Instruments | GR-202-EC |
References
- Fosgerau, K., Hoffmann, T. Peptide therapeutics: Current status and future directions. Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).
- Gongora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
- Tietze, A. A., et al. Structurally diverse µ-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4. Angewandte Chemie – International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).
- Carstens, B. B., et al. Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich α-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif. Angewandte Chemie – International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).
- Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide. Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).
- Nielsen, K. J., et al. Solution structure of µ-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).
- Heimer, P., et al. Conformational µ-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation. Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).
- Chang, J. Y. Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models. Biochemistry. 50 (17), 3414-3431 (2011).
- Böhm, M., et al. Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).
- Postma, T. M., Albericio, F. Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis. European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).
- Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. Amino Acid-Protecting Groups. Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).
- Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. Disulfide bond formation in peptides. Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).
- Kamber, B., et al. The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides. Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).
- Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins. Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).
- Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation. Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).
- Peigneur, S., et al. δ-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity. Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).
- Heimer, P., et al. Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides. ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).
- Kates, S. A., Albericio, F. . Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , (2000).
- Wüthrich, K. NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture). Angewandte Chemie – International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).
