Synthèse et détermination de Structure des isomères PIIIA µ-conotoxine avec disulfure différentes connectivités

L’utilisation de peptides bioactifs dans la recherche pharmaceutique et développement est hautement reconnue, parce qu’ils représentent les composés puissants et hautement sélectifs pour des cibles biologiques spécifiques¹. Pour leur bioactivité, cependant, la structure tridimensionnelle est d’une grande importance pour réaliser la structure-activité relation études^2,3,4. En dehors de la séquence primaire des acides aminés qui influe sur la conformation générale, liaisons disulfide stabilisent sensiblement la structure de peptides riches en cystéine⁵. Plusieurs peptides avec un pont disulfure incluent conotoxines comme µ-PIIIA de Conus purpurascens qui contient six cystéines dans sa séquence. Cette teneur élevée de cystéine permet théoriquement la formation des 15 disulfure isomères. La connectivité de disulfure correct est très importante pour l’activité biologique^6,7. Toutefois, la question qui se pose est si il n’y a plus d’une conformation bioactive peptides naturels et si oui, lequel de ces isomères possède la plus forte activité biologique ? Dans le cas de µ-conotoxines, les cibles biologiques sont des canaux ioniques de sodium voltage-dépendants, et µ-PIIIA en particulier est plus puissant pour les sous-types Na_V1.2, Na_V1.4 et Na_V1.7³.

La synthèse des peptides avec un pont disulfure est possible en utilisant différentes méthodes. La méthode la plus pratique pour la formation de ponts disulfures dans un peptide est l’approche dite de pliage automatique oxydatif. Ici, le linéaire précurseur du peptide cyclique désiré est synthétisé tout d’abord à l’aide de synthèse de peptide de phase solide, qui est après que le clivage de l’appui de polymère soumis à l’oxydation dans un système de tampon. Agents actifs en oxydoréduction comme le glutathion réduite et oxydée (GSH/GSSG) sont souvent ajoutés pour promouvoir la formation des liaisons disulfide. Le principal inconvénient du tampon-soutenu pliage automatique, c’est que les ponts disulfures ne forment pas sélectivement de façon progressive. Par rapport au peptide natif, pour lesquels, isomère disulfure spécifiques qu’un seul est souvent décrite, il est possible d’obtenir de nombreux autres isomères avec cette approche⁸. µ-PIIIA a déjà été montré se traduire par au moins trois isomères différemment pliés à pliage automatique dans une précédente étude³. La séparation d’un tel mélange d’isomère est assez difficile en raison des temps de rétention similaires si l’utilisation de méthodes de purification chromatographique⁹. La synthèse ciblée d’un isomère est donc avantageuse. Plus précisément les produits qu’un isomère avec connectivité disulfure définie, une stratégie spéciale est requise à laquelle adhère le disulfure sont successivement fermées. Par conséquent, le précurseur linéaire transportant des groupes protecteurs distinctes aux paires individuelles de cystéine est synthétisé sur le soutien de polymère. Après l’élimination, les paires de cystéine sont individuellement et successivement déprotégé et liée à une réaction d’oxydation pour donner le disulfure désiré obligations^{10,11,12,13, 14 , 15 , 16}. après la synthèse et la purification du produit de la réaction, il est nécessaire de confirmer l’identité et la connectivité du disulfure de méthodes analytiques appropriées. Il existe plusieurs méthodes d’analyse pour l’élucidation de la séquence primaire des acides aminés, par exemple., MS/MS, alors que la détermination de la connectivité de disulfure reste encore bien moins étudiée. En dehors de la complexité de ces multiples liaisons disulfure de peptides, impuretés issues du produit (p. ex.., du disulfure de brouillage), en raison de l’échantillon préparation et marche à suivre peuvent compliquer l’analyse. Dans cet article, nous montrons que l’utilisation d’une combinaison de différentes techniques d’analyse est nécessaire de préciser clairement l’identité des liaisons disulfide dans les isomères de µ-PIIIA. Nous avons combiné des méthodes chromatographiques avec la spectrométrie de masse et fourni les mêmes échantillons de spectroscopie RMN. En laser assistée par matrice desorption/ionization(MALDI) analyse MS/MS, nous avons identifié les ponts disulfures en utilisant la réduction partielle et dérivatisation iodoacétamide car analyse descendante n’est pas possible pour ce peptide. Des expériences RMN 2D ont été réalisées afin d’obtenir une structure tridimensionnelle de chaque isomère. Ainsi, en combinant différentes méthodes analytiques sophistiqués, il est possible d’élucider correctement le disulfure connectivité et la structure tridimensionnelle du complexe de plusieurs peptides disulfure-collé⁷.