Summary

Synthèse et détermination de Structure des isomères PIIIA µ-conotoxine avec disulfure différentes connectivités

Published: October 02, 2018
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Summary

Peptides riches en cystéine incorporer des structures en trois dimensions distinctes selon leur connectivité disulfure. Synthèse ciblée des isomères individuels disulfure est nécessaire lors de l’oxydation de la mémoire tampon ne conduit pas à la connectivité de disulfure désiré. Le protocole porte sur la synthèse sélective des peptides 3-disulfure-collé et leur analyse structurale à l’aide d’études RMN et SM/SM.

Abstract

Peptides avec un nombre élevé de cystéines sont habituellement influencés au sujet de la structure tridimensionnelle par leur connectivité disulfure. Il est donc très important d’éviter la formation de la liaison disulfure indésirables au cours de la synthèse peptidique, car elle peut entraîner dans une structure complètement différente de peptide et par conséquent modifié bioactivité. Toutefois, la formation correcte de multiples liaisons disulfide dans un peptide est difficile à obtenir en utilisant des méthodes pliantes automatique standards tels que les protocoles de tampons classiques d’oxydation, parce que plusieurs des connectivités disulfure peuvent se former. Ce protocole représente une stratégie avancée nécessaire pour la synthèse ciblée de plusieurs peptides avec un pont disulfure qui ne peuvent pas être synthétisés par l’oxydation de la mémoire tampon en qualité et en quantité. L’étude montre l’application d’une stratégie de groupe protecteur distincts pour la synthèse de tous les isomères possibles peptide 3-liaisons disulfure de µ-conotoxine PIIIA de manière ciblée. Les peptides sont préparées par synthèse de peptide de phase solide Fmoc-basé en utilisant une stratégie de groupe protecteur pour la formation de la liaison disulfure définis. Les paires respectives des cystéines sont protégés avec trityl (Trt), acétamidométhyle (Acm) et tert-butyle (t-Bu) protégeant les groupes pour s’assurer qu’au cours de chaque étape de l’oxydation seulement les cystéines requis sont déprotégés et liés. Outre la synthèse ciblée, une combinaison de plusieurs méthodes d’analyse sert à clarifier le pliage correct et la génération des structures peptidiques désirée. La comparaison entre les différents isomères de liaison disulfure-3 indique l’importance de déterminer avec précision et la connaissance de la connectivité de disulfure pour le calcul de la structure tridimensionnelle et interprétation de la Commission activité des isomères peptide. La caractérisation analytique comprend l’élucidation de liaison disulfure exacte via l’analyse de spectrométrie de masse (MS/MS) en tandem qui s’effectue avec des dérivés alkylés et partiellement réduits de l’isomère de peptide intact produites par un protocole adapté. En outre, les structures de peptide sont déterminées à l’aide d’expériences 2D par résonance magnétique nucléaire (RMN) et les connaissances obtenues par l’analyse MS/MS.

Introduction

L’utilisation de peptides bioactifs dans la recherche pharmaceutique et développement est hautement reconnue, parce qu’ils représentent les composés puissants et hautement sélectifs pour des cibles biologiques spécifiques1. Pour leur bioactivité, cependant, la structure tridimensionnelle est d’une grande importance pour réaliser la structure-activité relation études2,3,4. En dehors de la séquence primaire des acides aminés qui influe sur la conformation générale, liaisons disulfide stabilisent sensiblement la structure de peptides riches en cystéine5. Plusieurs peptides avec un pont disulfure incluent conotoxines comme µ-PIIIA de Conus purpurascens qui contient six cystéines dans sa séquence. Cette teneur élevée de cystéine permet théoriquement la formation des 15 disulfure isomères. La connectivité de disulfure correct est très importante pour l’activité biologique6,7. Toutefois, la question qui se pose est si il n’y a plus d’une conformation bioactive peptides naturels et si oui, lequel de ces isomères possède la plus forte activité biologique ? Dans le cas de µ-conotoxines, les cibles biologiques sont des canaux ioniques de sodium voltage-dépendants, et µ-PIIIA en particulier est plus puissant pour les sous-types NaV1.2, NaV1.4 et NaV1.73.

La synthèse des peptides avec un pont disulfure est possible en utilisant différentes méthodes. La méthode la plus pratique pour la formation de ponts disulfures dans un peptide est l’approche dite de pliage automatique oxydatif. Ici, le linéaire précurseur du peptide cyclique désiré est synthétisé tout d’abord à l’aide de synthèse de peptide de phase solide, qui est après que le clivage de l’appui de polymère soumis à l’oxydation dans un système de tampon. Agents actifs en oxydoréduction comme le glutathion réduite et oxydée (GSH/GSSG) sont souvent ajoutés pour promouvoir la formation des liaisons disulfide. Le principal inconvénient du tampon-soutenu pliage automatique, c’est que les ponts disulfures ne forment pas sélectivement de façon progressive. Par rapport au peptide natif, pour lesquels, isomère disulfure spécifiques qu’un seul est souvent décrite, il est possible d’obtenir de nombreux autres isomères avec cette approche8. µ-PIIIA a déjà été montré se traduire par au moins trois isomères différemment pliés à pliage automatique dans une précédente étude3. La séparation d’un tel mélange d’isomère est assez difficile en raison des temps de rétention similaires si l’utilisation de méthodes de purification chromatographique9. La synthèse ciblée d’un isomère est donc avantageuse. Plus précisément les produits qu’un isomère avec connectivité disulfure définie, une stratégie spéciale est requise à laquelle adhère le disulfure sont successivement fermées. Par conséquent, le précurseur linéaire transportant des groupes protecteurs distinctes aux paires individuelles de cystéine est synthétisé sur le soutien de polymère. Après l’élimination, les paires de cystéine sont individuellement et successivement déprotégé et liée à une réaction d’oxydation pour donner le disulfure désiré obligations10,11,12,13, 14 , 15 , 16. après la synthèse et la purification du produit de la réaction, il est nécessaire de confirmer l’identité et la connectivité du disulfure de méthodes analytiques appropriées. Il existe plusieurs méthodes d’analyse pour l’élucidation de la séquence primaire des acides aminés, par exemple., MS/MS, alors que la détermination de la connectivité de disulfure reste encore bien moins étudiée. En dehors de la complexité de ces multiples liaisons disulfure de peptides, impuretés issues du produit (p. ex.., du disulfure de brouillage), en raison de l’échantillon préparation et marche à suivre peuvent compliquer l’analyse. Dans cet article, nous montrons que l’utilisation d’une combinaison de différentes techniques d’analyse est nécessaire de préciser clairement l’identité des liaisons disulfide dans les isomères de µ-PIIIA. Nous avons combiné des méthodes chromatographiques avec la spectrométrie de masse et fourni les mêmes échantillons de spectroscopie RMN. En laser assistée par matrice desorption/ionization(MALDI) analyse MS/MS, nous avons identifié les ponts disulfures en utilisant la réduction partielle et dérivatisation iodoacétamide car analyse descendante n’est pas possible pour ce peptide. Des expériences RMN 2D ont été réalisées afin d’obtenir une structure tridimensionnelle de chaque isomère. Ainsi, en combinant différentes méthodes analytiques sophistiqués, il est possible d’élucider correctement le disulfure connectivité et la structure tridimensionnelle du complexe de plusieurs peptides disulfure-collé7.

Protocol

Remarque : Tous les acides aminés utilisés dans les présentes étaient dans la configuration L. Les abréviations des acides aminés et les acides aminés dérivés ont été utilisées conformément aux recommandations de la Commission de la Nomenclature de IUB et la Commission mixte de l’IUPAC-IUB sur la Nomenclature biochimique. 1. Phase solide de Peptide synthèse (SPPS) Remarque : Réaliser la synthèse avec un synthétiseur de peptide de phase solide. Eff…

Representative Results

15 différents isomères avec un pont disulfure de la µ-conotoxine PIIIA sont synthétisés et caractérisés en détail (Figure 1). Les liaisons disulfide sont identifiés par une réduction partielle et l’analyse ultérieure de MS/MS (Figure 2). Analyse par RMN des différents isomères est effectuée (Figure 3) pour révéler les structures peptidiques individuels. Notamment, une combinaison de…

Discussion

La méthode décrite ici pour la synthèse des peptides riches en cystéine tels que µ-PIIIA représente une possibilité pour produire sélectivement les isomères de liaison disulfure de la même séquence d’acides aminés. Par conséquent, mis en place des méthodes telles que solide axée sur le Fmoc phase de synthèse de peptide18 et une stratégie de groupe protecteur définie pour la formation régiosélective des ponts disulfures ont utilisé16. La synthèse de p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier A. Resemann, F. J. Mayer et D. de Suckau de Bruker Daltonics GmbH Brême ; D. Tietze, A. A. Tietze, Schmidts V. et C. Thiele de l’Université de technologie de Darmstadt ; O. Ohlenschläger de l’Iéna FLI, M. Engeser de l’Université de Bonn ; K. Kramer, A. Harzen et H. Nakagami, de l’Institut Max Planck pour Plant Breeding Research, Cologne ; Susanne Neupert de l’Institut de zoologie, Cologne ; et les installations biomoléculaire de spectroscopie par résonance magnétique de l’Université de Francfort pour technique prend en charge, modules, de formation et d’accès aux instruments. Soutien financier de l’Université de Bonn à D.I. tient à reconnaître.

Materials

Fmoc Rink amide resin Novabiochem 855001
Pyr(Boc) Bachem A-3850
Arg(Pbf) Iris Biotech FSC1010
Asn(Trt) Bachem B-1785
Asp(tBu) Iris Biotech FSP1020
Hyp(tBu) Iris Biotech FAA1627
Lys(Boc) Bachem B-1080
Ser(tBu) Iris Biotech FSC1190
Gln(Trt) Iris Biotech FSC1043
Glu(tBu) Iris Biotech FSP1045
Trp(Boc) Iris Biotech FSC1225
Tyr(tBu) Sigma Aldrich 47623
Thr(tBu) Iris Biotech FSP1210
His(Trt) Iris Biotech FDP1200
2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat Sigma Aldrich 8510060 Flammable
DMF Fisher Scientific D119 Flammable, Toxic
DCM Fisher Scientific D37 Carcinogenic
Piperidine Alfa Aesar A12442 Flammable, Toxic, Corrosive
N-Methyl-Morpholin Sigma Aldrich 224286
Cys(Acm) Iris Biotech FAA1506
Cys(Trt) Bachem E-2495
Cys(tBu) Bachem B-1220
trifluoruacetic acid Sigma Aldrich 74564 Toxic, Corrosive
phenol Merck 1002060 Toxic
thioanisol Alfa Aesar A14846
ethanedithiol Fluka Analytical 2390
diethyl ether VWR 100,921 Flammable
tert-butanol Alfa Aesar L12338 Flammable
acetonitrile Fisher Scientific A998 Flammable
water Fisher Scientific W5
isopropanol VWR ACRO42383 Flammable
sodium hydroxide AppliChem A6579,1000 Corrosive
iodoacetamide Sigma Aldrich I6125
iodine Sigma Aldrich I0385
Hydrochloric acid Merck 110165 Corrosive
ascorbic acid Sigma Aldrich A4403
diphenylsulfoxide Sigma Aldrich P35405
anisol Sigma Aldrich 96109 Flammable
trichloromethylsilane Sigma Aldrich M85301 Flammable
sample dilution buffer Laborservice Onken
sodium dihydrogen phosphate Sigma Aldrich 106370
disodium hydrogen phosphate Sigma Aldrich 795410
(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma Aldrich C4706
citric acid Sigma Aldrich 251275
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
tris-acetate Carl Roth,  7125
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma Aldrich E26282 
peptide calibration standard II Bruker Daltonics GmbH 8222570
Name of Equipment Company
solid-phase peptide synthesizer Intavis Bioanalytical Instruments AG EPS 221
lyophilizer  Martin Christ GmbH  Alpha 1-2 Ldplus
semipreparative HPLC Jasco system PV-987
Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) Knauer 25QE181E2J purification of the linear peptide
Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) Hichrom-VWR HICH218TP1022 purification of the oxidized peptide
analytical HPLC  Shimadzu system LC-20AD
Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm)  Hichrom-VWR HICH218TP54 analytical column
ground steel target (MTP 384) Bruker Daltonics GmbH NC0910436 MALDI preparation 
C18-concentration filter (ZipTip) Merck KGaA ZTC18S096 MALDI preparation 
MALDI mass spectrometer Bruker Daltonics GmbH ultraflex III TOF/TOF
amino acid analyzer Eppendorf-Biotronik GmbH LC 3000 system
NMR spectrometer Bruker Avance III Bruker Daltonics GmbH Bruker Avance III 600 MHz
computer program for molecular visualising YASARA Biosciences GmbH Yasara structures NMR structure calculation
computer program for MALDI data evaluation  Bruker Daltonics GmbH flexAnalysis, BioTools MS/MS fragmentation
analog vortex mixer VWR VM 3000
Microcentrifuge Eppendorf 5410
Centrifuge Hettich EBA 20
Rotational vacuum concentrator Christ 2-18 Cdplus
Analytical Balance A&D Instruments GR-202-EC

References

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Cite This Article
Heimer, P., Schmitz, T., Bäuml, C. A., Imhof, D. Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. J. Vis. Exp. (140), e58368, doi:10.3791/58368 (2018).

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