Summary

Síntesis y determinación estructural de μ-Conotoxina PIIIA isómeros con disulfuro diferentes conectividades

Published: October 02, 2018
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Summary

Péptidos ricos en cisteína doblan en estructuras tridimensionales distintas dependiendo de la conectividad de disulfuro. Específicas síntesis de isómeros individuales disulfuro es necesario oxidación de búfer no conduce a la conectividad deseada disulfuro. El protocolo aborda la síntesis selectiva de péptidos 3-disulfuro-consolidado y su análisis estructural mediante estudios NMR y MS/MS.

Abstract

Péptidos con un elevado número de cisteínas son influenciados generalmente con respecto a la estructura tridimensional por su conectividad de disulfuro. Por lo tanto es muy importante para evitar la formación de Enlace disulfuro no deseados durante la síntesis de péptidos, porque puede dar lugar a una estructura completamente diferente de péptidos y en consecuencia alterado bioactividad. Sin embargo, la correcta formación de múltiples enlaces de disulfuro en un péptido es difícil de obtener mediante métodos auto plegables estándar tales como protocolos de la oxidación del tampón convencional, porque pueden formar varias conectividades de disulfuro. Este protocolo representa una avanzada estrategia necesaria para la síntesis específica de múltiples péptidos puente disulfuro que no pueden ser sintetizados vía oxidación de búfer en alta calidad y cantidad. El estudio demuestra la aplicación de una estrategia de grupo protección distinta para la síntesis de todos los isómeros posibles péptidos 3-disulfuro-consolidado de μ-Conotoxina PIIIA una manera específica. Los péptidos son preparados por síntesis de péptidos de fase sólida basado en el Fmoc utilizando una estrategia de protección del grupo para la formación del Enlace disulfuro definida. Los respectivos pares de cisteínas están protegidos con trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) y terc-butilo (tBu) proteger grupos para asegurarse de que durante cada paso de oxidación sólo las cisteínas requiere deprotected y vinculados. Además la síntesis específica, una combinación de varios métodos analíticos se usa para aclarar el plegamiento correcto y la generación de las estructuras de péptido deseado. La comparación de los diferentes isómeros 3-disulfuro-consolidado indica la importancia de la determinación precisa y el conocimiento de la conectividad de disulfuro para el cálculo de la estructura tridimensional y para la interpretación de lo biológico actividad de los isómeros del péptido. La caracterización analítica incluye la aclaración de Enlace disulfuro exacta vía análisis de espectrometría de masas (MS/MS) de tándem que se realiza con derivados alkylated y parcialmente reducidos del isómero intactas péptido producido por un protocolo adaptado. Además, las estructuras de péptidos se determinan mediante experimentos 2D de resonancia magnética nuclear (RMN) y el conocimiento obtenidos del análisis MS/MS.

Introduction

El uso de péptidos bioactivos en investigación farmacéutica y desarrollo es altamente reconocido, debido a que representan compuestos potentes y altamente selectivos para objetivos biológicos específicos1. Para su bioactividad, sin embargo, la estructura tridimensional es de gran importancia para realizar la estructura y actividad relación estudios2,3,4. Aparte de la secuencia primaria del aminoácido que influye en la conformación general, enlaces de disulfuro estabilizan significativamente la estructura de péptidos ricos en cisteína5. Varios péptidos puente disulfuro incluyen conotoxinas como μ-PIIIA de Conus purpurascens que contiene seis cisteínas en su secuencia. Este contenido de cisteína alta permite teóricamente la formación de 15 isómeros de disulfuro. La conectividad de disulfuro correcto es muy importante para la actividad biológica6,7. ¿Sin embargo, la pregunta que surge es si existe más de una conformación bioactivo péptidos naturalmente y si por lo tanto, cuál de los isómeros posee la más alta actividad biológica? En el caso de μ-conotoxinas, los blancos biológicos son canales de sodio voltaje-bloqueado del ion, y μ-PIIIA en particular es más potente para los subtipos de NaV1.2, NaV1.4 y NaV1.73.

La síntesis de péptidos puente disulfuro puede lograrse usando varios métodos. El método más conveniente para la formación de enlaces disulfuro dentro de un péptido es el llamado enfoque auto plegable oxidativo. Aquí, el precursor lineal del péptido cíclico deseado se sintetiza primero usando la síntesis de péptidos de fase sólida, que es después de la ruptura del soporte polimérico sometidos a oxidación en un sistema de buffer. Agentes redox activos como el glutation reducido y oxidado (GSH/GSSG) se agregan a menudo para promover la formación de los enlaces de disulfuro. La principal desventaja de buffer compatible auto plegable es que los enlaces de disulfuro se forman no selectivamente de manera gradual. Comparado con el péptido nativo, que a menudo isómero disulfuro específica solo se describe, es posible obtener numerosos otros isómeros con este enfoque8. Μ-PIIIA ya se ha demostrado para dar lugar a isómeros diferentemente doblados por lo menos tres a uno plegable en un anterior estudio3. La separación de una mezcla de isómero es algo difícil debido a los tiempos de retención similares si el uso de métodos de purificación cromatográfica9. La síntesis específica de un isómero específico, por tanto, es ventajosa. En concreto produce que un isómero con conectividad de disulfuro definido, una estrategia especial se requiere que el disulfuro de bonos sucesivamente están cerrados. Por lo tanto, el precursor lineal llevando grupos distintos de protección en los pares individuales de cisteína se sintetiza en el soporte de polímero. Después de la eliminación, los pares de cisteína individual y sucesivamente deprotected y vinculados en una reacción de oxidación para producir la deseada disulfuro bonos10,11,12,13, 14 , 15 , 16. después de la síntesis y la purificación del producto de la reacción, es necesaria para confirmar la identidad y la conectividad de disulfuro por métodos analíticos apropiados. Numerosos métodos analíticos están disponibles para la elucidación de la secuencia primaria de aminoácidos, por ejemplo., MS/MS, mientras que la determinación de la conectividad de disulfuro sigue siendo mucho menos investigada. Aparte de la complejidad de tales múltiples péptidos disulfuro-consolidado, impurezas relacionadas con el producto (ej., de disulfuro el revolver), debido a la muestra de preparación y el work-up pueden complicar más análisis. En este trabajo, nos muestran que el uso de una combinación de diferentes técnicas analíticas es necesario aclarar inequívocamente la identidad de los enlaces de disulfuro en los isómeros de μ-PIIIA. Hemos combinado métodos de cromatografía con espectrometría de masas y siempre las mismas muestras para espectroscopia de RMN. En desorption/ionization(MALDI) láser asistida por matriz de análisis MS/MS, identificamos el disulfuro mediante reducción parcial y derivatización de Yodoacetamida porque análisis de arriba hacia abajo no es posible que este péptido. Se realizaron experimentos de NMR 2D para obtener una estructura tridimensional de cada isómero. Así, combinando distintos métodos analíticos sofisticados, es posible dilucidar adecuadamente el disulfuro conectividad y estructura tridimensional del complejo de múltiples péptidos disulfuro-consolidado7.

Protocol

Nota: Todos los aminoácidos en este documento fueron en la configuración L. Se utilizan las abreviaturas de los aminoácidos y derivados de aminoácidos según las recomendaciones de la Comisión del IUB de nomenclatura y de la Comisión conjunta de IUPAC-IUB de nomenclatura bioquímica. 1. síntesis de péptidos fase sólida (SPPS) Nota: Realizar la síntesis con un sintetizador de péptidos de fase sólida. Realizar la síntesis de los precursores del péptido lin…

Representative Results

15 diferentes isómeros puente disulfuro de la μ-Conotoxina PIIIA sintetizados y caracterizados en detalle (figura 1). Enlaces de disulfuro son identificados por reducción parcial y posterior análisis de MS/MS (figura 2). Análisis de NMR de los isómeros diferentes se lleva a cabo (figura 3) para revelar las estructuras de los péptidos. En particular, una combinación de RP HPLC, fragmentación …

Discussion

El método descrito en este documento para la síntesis de péptidos ricos en cisteína como μ-PIIIA representa una posibilidad para producir selectivamente disulfuro-consolidado isómeros de la misma secuencia de aminoácidos. Por lo tanto, estableció métodos como sólida base de Fmoc fase de síntesis de péptido18 y una estrategia de grupo de protección definida para la formación regioselectiva de disulfuro fueron utilizadas16. La síntesis del peptide de la fase s?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a A. Resemann, F. J. Mayer y D. Suckau de Bruker Daltonics GmbH Bremen; D. Tietze, A. A. Tietze, V. Schmidts y Thiele C. de la Universidad Tecnológica de Darmstadt; O. Ohlenschläger de la Jena FLI, M. Engeser de la Universidad de Bonn; K. Kramer, A. Harzen y H. Nakagami del Instituto Max Planck para la investigación de crianza de planta, Colonia; Susanne Neupert del Instituto de Zoología de la Colonia; y las instalaciones de espectroscopia de resonancia magnética Biomolecular de la Universidad de Francfort para técnico soporte, módulos, de formación y acceso a instrumentos. Se agradece el apoyo financiero de la Universidad de Bonn a D.I..

Materials

Fmoc Rink amide resin Novabiochem 855001
Pyr(Boc) Bachem A-3850
Arg(Pbf) Iris Biotech FSC1010
Asn(Trt) Bachem B-1785
Asp(tBu) Iris Biotech FSP1020
Hyp(tBu) Iris Biotech FAA1627
Lys(Boc) Bachem B-1080
Ser(tBu) Iris Biotech FSC1190
Gln(Trt) Iris Biotech FSC1043
Glu(tBu) Iris Biotech FSP1045
Trp(Boc) Iris Biotech FSC1225
Tyr(tBu) Sigma Aldrich 47623
Thr(tBu) Iris Biotech FSP1210
His(Trt) Iris Biotech FDP1200
2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat Sigma Aldrich 8510060 Flammable
DMF Fisher Scientific D119 Flammable, Toxic
DCM Fisher Scientific D37 Carcinogenic
Piperidine Alfa Aesar A12442 Flammable, Toxic, Corrosive
N-Methyl-Morpholin Sigma Aldrich 224286
Cys(Acm) Iris Biotech FAA1506
Cys(Trt) Bachem E-2495
Cys(tBu) Bachem B-1220
trifluoruacetic acid Sigma Aldrich 74564 Toxic, Corrosive
phenol Merck 1002060 Toxic
thioanisol Alfa Aesar A14846
ethanedithiol Fluka Analytical 2390
diethyl ether VWR 100,921 Flammable
tert-butanol Alfa Aesar L12338 Flammable
acetonitrile Fisher Scientific A998 Flammable
water Fisher Scientific W5
isopropanol VWR ACRO42383 Flammable
sodium hydroxide AppliChem A6579,1000 Corrosive
iodoacetamide Sigma Aldrich I6125
iodine Sigma Aldrich I0385
Hydrochloric acid Merck 110165 Corrosive
ascorbic acid Sigma Aldrich A4403
diphenylsulfoxide Sigma Aldrich P35405
anisol Sigma Aldrich 96109 Flammable
trichloromethylsilane Sigma Aldrich M85301 Flammable
sample dilution buffer Laborservice Onken
sodium dihydrogen phosphate Sigma Aldrich 106370
disodium hydrogen phosphate Sigma Aldrich 795410
(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma Aldrich C4706
citric acid Sigma Aldrich 251275
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
tris-acetate Carl Roth,  7125
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma Aldrich E26282 
peptide calibration standard II Bruker Daltonics GmbH 8222570
Name of Equipment Company
solid-phase peptide synthesizer Intavis Bioanalytical Instruments AG EPS 221
lyophilizer  Martin Christ GmbH  Alpha 1-2 Ldplus
semipreparative HPLC Jasco system PV-987
Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) Knauer 25QE181E2J purification of the linear peptide
Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) Hichrom-VWR HICH218TP1022 purification of the oxidized peptide
analytical HPLC  Shimadzu system LC-20AD
Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm)  Hichrom-VWR HICH218TP54 analytical column
ground steel target (MTP 384) Bruker Daltonics GmbH NC0910436 MALDI preparation 
C18-concentration filter (ZipTip) Merck KGaA ZTC18S096 MALDI preparation 
MALDI mass spectrometer Bruker Daltonics GmbH ultraflex III TOF/TOF
amino acid analyzer Eppendorf-Biotronik GmbH LC 3000 system
NMR spectrometer Bruker Avance III Bruker Daltonics GmbH Bruker Avance III 600 MHz
computer program for molecular visualising YASARA Biosciences GmbH Yasara structures NMR structure calculation
computer program for MALDI data evaluation  Bruker Daltonics GmbH flexAnalysis, BioTools MS/MS fragmentation
analog vortex mixer VWR VM 3000
Microcentrifuge Eppendorf 5410
Centrifuge Hettich EBA 20
Rotational vacuum concentrator Christ 2-18 Cdplus
Analytical Balance A&D Instruments GR-202-EC

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Cite This Article
Heimer, P., Schmitz, T., Bäuml, C. A., Imhof, D. Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. J. Vis. Exp. (140), e58368, doi:10.3791/58368 (2018).

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