Síntesis y determinación estructural de μ-Conotoxina PIIIA isómeros con disulfuro diferentes conectividades

El uso de péptidos bioactivos en investigación farmacéutica y desarrollo es altamente reconocido, debido a que representan compuestos potentes y altamente selectivos para objetivos biológicos específicos¹. Para su bioactividad, sin embargo, la estructura tridimensional es de gran importancia para realizar la estructura y actividad relación estudios^2,3,4. Aparte de la secuencia primaria del aminoácido que influye en la conformación general, enlaces de disulfuro estabilizan significativamente la estructura de péptidos ricos en cisteína⁵. Varios péptidos puente disulfuro incluyen conotoxinas como μ-PIIIA de Conus purpurascens que contiene seis cisteínas en su secuencia. Este contenido de cisteína alta permite teóricamente la formación de 15 isómeros de disulfuro. La conectividad de disulfuro correcto es muy importante para la actividad biológica^6,7. ¿Sin embargo, la pregunta que surge es si existe más de una conformación bioactivo péptidos naturalmente y si por lo tanto, cuál de los isómeros posee la más alta actividad biológica? En el caso de μ-conotoxinas, los blancos biológicos son canales de sodio voltaje-bloqueado del ion, y μ-PIIIA en particular es más potente para los subtipos de Na_V1.2, Na_V1.4 y Na_V1.7³.

La síntesis de péptidos puente disulfuro puede lograrse usando varios métodos. El método más conveniente para la formación de enlaces disulfuro dentro de un péptido es el llamado enfoque auto plegable oxidativo. Aquí, el precursor lineal del péptido cíclico deseado se sintetiza primero usando la síntesis de péptidos de fase sólida, que es después de la ruptura del soporte polimérico sometidos a oxidación en un sistema de buffer. Agentes redox activos como el glutation reducido y oxidado (GSH/GSSG) se agregan a menudo para promover la formación de los enlaces de disulfuro. La principal desventaja de buffer compatible auto plegable es que los enlaces de disulfuro se forman no selectivamente de manera gradual. Comparado con el péptido nativo, que a menudo isómero disulfuro específica solo se describe, es posible obtener numerosos otros isómeros con este enfoque⁸. Μ-PIIIA ya se ha demostrado para dar lugar a isómeros diferentemente doblados por lo menos tres a uno plegable en un anterior estudio³. La separación de una mezcla de isómero es algo difícil debido a los tiempos de retención similares si el uso de métodos de purificación cromatográfica⁹. La síntesis específica de un isómero específico, por tanto, es ventajosa. En concreto produce que un isómero con conectividad de disulfuro definido, una estrategia especial se requiere que el disulfuro de bonos sucesivamente están cerrados. Por lo tanto, el precursor lineal llevando grupos distintos de protección en los pares individuales de cisteína se sintetiza en el soporte de polímero. Después de la eliminación, los pares de cisteína individual y sucesivamente deprotected y vinculados en una reacción de oxidación para producir la deseada disulfuro bonos^{10,11,12,13, 14 , 15 , 16}. después de la síntesis y la purificación del producto de la reacción, es necesaria para confirmar la identidad y la conectividad de disulfuro por métodos analíticos apropiados. Numerosos métodos analíticos están disponibles para la elucidación de la secuencia primaria de aminoácidos, por ejemplo., MS/MS, mientras que la determinación de la conectividad de disulfuro sigue siendo mucho menos investigada. Aparte de la complejidad de tales múltiples péptidos disulfuro-consolidado, impurezas relacionadas con el producto (ej., de disulfuro el revolver), debido a la muestra de preparación y el work-up pueden complicar más análisis. En este trabajo, nos muestran que el uso de una combinación de diferentes técnicas analíticas es necesario aclarar inequívocamente la identidad de los enlaces de disulfuro en los isómeros de μ-PIIIA. Hemos combinado métodos de cromatografía con espectrometría de masas y siempre las mismas muestras para espectroscopia de RMN. En desorption/ionization(MALDI) láser asistida por matriz de análisis MS/MS, identificamos el disulfuro mediante reducción parcial y derivatización de Yodoacetamida porque análisis de arriba hacia abajo no es posible que este péptido. Se realizaron experimentos de NMR 2D para obtener una estructura tridimensional de cada isómero. Así, combinando distintos métodos analíticos sofisticados, es posible dilucidar adecuadamente el disulfuro conectividad y estructura tridimensional del complejo de múltiples péptidos disulfuro-consolidado⁷.