Síntese e determinação da estrutura de µ-conotoxina PIIIA isômeros com bissulfeto diferentes conetividades

O uso de peptídeos bioativos em pesquisa farmacêutica e desenvolvimento é altamente reconhecido, porque eles representam compostos potentes e altamente seletivos para alvos biológicos específicos¹. Para sua bioatividade, no entanto, a estrutura tridimensional é de grande importância a fim de realizar a relação estrutura-atividade estudos^2,3,de⁴. Além da sequência de aminoácidos primários que influencia a conformação geral, ligações de bissulfeto significativamente estabilizem a estrutura de peptídeos ricos em cisteína⁵. Vários peptídeos em ponte dissulfeto incluem conotoxins como µ-PIIIA de Conus purpurascens que contém seis cisteínas na sua sequência. Este conteúdo elevado de cisteína, teoricamente, permite a formação de 15 isómeros de dissulfeto. A conectividade de bissulfeto correta é muito importante para a atividade biológica^6,7. No entanto, a pergunta que surge é se há mais de uma conformação Bioativo de peptídeos naturais e se então, que os isómeros possui a maior atividade biológica? No caso de µ-conotoxins, os alvos biológicos são canais de íon sódio voltagem-dependentes, e µ-PIIIA em particular é mais potente para subtipos de nd nd_V1.2,_V1.4 e at_V1.7³.

A síntese de peptídeos em ponte dissulfeto pode ser conseguida usando vários métodos. O método mais conveniente para a formação de ligações de bissulfeto dentro de um peptídeo é a chamada abordagem Self dobramento oxidativa. Aqui, o precursor linear do peptide cíclico desejado é sintetizado primeiro usando a síntese do peptide de fase sólida, que é após a clivagem do suporte polimérico submetidos a oxidação em um sistema de buffer. Agentes de redox-ativo como glutationa oxidada e reduzida (GSH/GSSG) são frequentemente adicionados para promover a formação das ligações de bissulfeto. A principal desvantagem do self com suporte buffer de dobramento é que as ligações dissulfureto são formadas não seletivamente de forma gradual. Comparado com o peptídeo nativo, para o qual muitas vezes é descrito isômero bissulfeto específico apenas um, é possível obter inúmeros outros isômeros com esta abordagem⁸. µ-PIIIA já foi mostrado para resultar em pelo menos três isômeros diferentemente dobrados sobre self dobrar em um estudo anterior³. A separação de tal uma mistura de isômero é um pouco difícil devido a tempos de retenção similares se utilizando de métodos cromatográficos de purificação⁹. A síntese de alvo de um isómero específico, portanto, é vantajosa. Para especificamente produzir que um isômero com conectividade de bissulfeto definido, uma estratégia especial é necessário que o dissulfeto títulos sucessivamente estão fechadas. Portanto, o precursor linear carregando grupos distintos protegendo os pares individuais cisteína é sintetizado com o apoio do polímero. Após a eliminação, os pares de cisteína são individualmente e sucessivamente deprotected e ligados em uma reação de oxidação para produzir o desejado dissulfeto títulos^{10,11,12,13, 14 , 15 , 16}. após a síntese e a purificação do produto da reação, é necessário para confirmar a identidade e a conectividade de dissulfeto por métodos analíticos apropriados. Numerosos métodos analíticos estão disponíveis para a elucidação da sequência primária de aminoácidos, por exemplo., MS/MS, enquanto a determinação da conectividade bissulfeto continua a ser muito menos investigada. Além da complexidade de tais vários peptídeos dissulfeto-ligado, impurezas relacionados com o produto (ex., de bissulfeto lutando), devido à amostra preparação e check-up podem complicar ainda mais as análises. Neste trabalho, mostramos que o uso de uma combinação de diferentes técnicas analíticas é necessário clarificar inequivocamente a identidade das ligações de bissulfeto nos isómeros µ-PIIIA. Nós temos combinado métodos de cromatografia em fase gasosa com espectrometria de massa e desde que as mesmas amostras para espectroscopia RMN. Em matrix-assisted laser desorption/ionization(MALDI) MS/MS análise, identificamos as ligações de bissulfeto usando redução parcial e iodoacetamide derivatização porque análise top-down, não é possível para este peptídeo. 2D NMR experimentos foram realizados a fim de obter uma estrutura tridimensional de cada isômero. Assim, combinando diferentes métodos analíticos sofisticados, é possível elucidar corretamente a conectividade de bissulfeto e estrutura tridimensional do complexo vários peptídeos dissulfeto-ligado⁷.