Synthese en structuurbepaling van µ-Conotoxin PIIIA-isomeren met verschillende Disulfide Connectivities

Het gebruik van bioactieve peptiden in farmaceutisch onderzoek en ontwikkeling is zeer erkend, omdat zij krachtige en zeer selectieve compounds voor specifieke biologische doelstellingen¹vertegenwoordigen. Voor hun topicale is de driedimensionale structuur echter van groot belang om uit te voeren van de relatie van structuur-activiteit studies^2,3,4. Afgezien van de volgorde van het primaire aminozuur die invloed op de algehele bevleesdheid, stabiliseren bisulfide obligaties aanzienlijk de structuur van cysteïne-rijke peptides⁵. Meerdere bisulfide-overbrugd peptiden omvatten conotoxins zoals µ-PIIIA van de Conus purpurascens waarin zes cysteines in zijn reeks. Deze hoge cysteïne-inhoud kunt theoretisch de vorming van 15 bisulfide isomeren. De juiste bisulfide-connectiviteit is heel belangrijk voor de biologische activiteit^6,7. Echter, de vraag die rijst is of er meer dan één bioactieve conformatie van nature voorkomende peptides en als zo, welke van die isomeren de hoogste biologische activiteit bezit? In het geval van µ-conotoxins, de biologische doelstellingen zijn natrium spanning-gated ionenkanalen en µ-PIIIA in het bijzonder is meest potente voor subtypen nb_V1.2, nb_V1.4 en nb_V1.7³.

De synthese van peptiden bisulfide-overbrugd kan worden bereikt met behulp van verschillende methoden. De meest geschikte methode voor de vorming van disulfide bindingen binnen een peptide is de zogenaamde oxidatieve zelf vouwen benadering. Hier wordt de lineaire voorloper van de gewenste cyclisch peptide gesynthetiseerd eerst met behulp van solid-phase peptide synthese, die immers het splijten van de polymere steun onderworpen aan oxidatie in een buffersysteem. Redox-actieve agentia zoals verminderde en geoxideerd glutathion (GSH/GSSG) worden vaak toegevoegd ter bevordering van de vorming van de disulfide bindingen. Het grootste nadeel van de buffer-ondersteund zelf vouwen is dat de disulfide bindingen niet selectief worden gevormd op een stapsgewijze manier. In vergelijking met de inheemse peptide, waarvoor vaak slechts één specifieke bisulfide isomeer wordt beschreven, is het mogelijk om talrijke andere isomeren met deze aanpak⁸. µ-PIIIA is reeds aangetoond dat resulteren in ten minste drie anders gevouwen isomeren op zelf in een eerdere studie³vouwen. De scheiding van dergelijke een mengsel van isomeer is nogal moeilijk als gevolg van soortgelijke retentietijden als chromatografische zuivering methoden⁹gebruikt. De gerichte synthese van een specifiek isomeer is dus gunstig. Specifiek producten die een isomeer met gedefinieerde bisulfide connectiviteit, een speciale strategie nodig is die de bisulfide obligaties zijn achtereenvolgens gesloten. Daarom wordt de lineaire voorloper uitvoering van verschillende beschermen groepen in de individuele cysteïne pairs gesynthetiseerd op de steun van het polymeer. Na de verwijdering, de cysteïne-paren zijn individueel en achtereenvolgens deprotected en verbonden in een oxidatie-reactie op de opbrengst van de gewenste bisulfide obligaties^{10,11,12,13, 14 , 15 , 16}. na de synthese en de zuivering van het reactieproduct, dat is vereist ter bevestiging van de identiteit en de connectiviteit bisulfide geschikte analysemethoden. Tal van analytische methoden zijn beschikbaar voor de opheldering van de volgorde van de primaire aminozuur, bijv., MS/MS, terwijl de bepaling van de bisulfide-connectiviteit is nog steeds veel minder onderzocht. Afgezien van de complexiteit van dergelijke meerdere bisulfide-gebonden peptides, productgerelateerde onzuiverheden (bv., van bisulfide versluiering), als gevolg van monster voorbereiding en werk-up kunnen verder compliceren analyse. In dit artikel laten we zien dat het gebruik van een combinatie van verschillende analytische technieken nodig is om de identiteit van de disulfide bindingen in de µ-PIIIA-isomeren ondubbelzinnig te verduidelijken. Wij hebben chromatografische methoden gecombineerd met massaspectrometrie en verstrekt de zelfde monsters naar NMR spectroscopie. In de laser matrix-bijgewoonde desorption/ionization(MALDI) MS/MS-analyse geïdentificeerd we de disulfide bindingen met behulp van gedeeltelijke vermindering en iodoacetamide bewerking omdat top-down analyse niet mogelijk voor dit peptide is. 2D NMR experimenten werden uitgevoerd met het oog op een driedimensionale structuur van elke isomeer. Door het combineren van verschillende geavanceerde analytische methoden, is het dus mogelijk ophelderen goed de bisulfide connectiviteit en de driedimensionale structuur van complex meerdere bisulfide-gebonden peptiden⁷.