Summary

Sintesi e determinazione della struttura di µ-conotossina PIIIA isomeri con bisolfuro diverse connettività

Published: October 02, 2018
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Summary

Ricche di cisteina peptidi piegare in strutture tridimensionali distinte a seconda della loro connettività di bisolfuro. Sintesi mirata di isomeri di bisolfuro individuali sono necessaria quando ossidazione buffer non comporta la connettività di bisolfuro desiderata. Il protocollo riguarda la sintesi selettiva dei peptidi 3-bisolfuro-legato e loro analisi strutturale mediante studi NMR e MS/MS.

Abstract

Peptidi con un elevato numero di cisteine sono influenzati solitamente per quanto riguarda la struttura tridimensionale di loro connettività di bisolfuro. Così è molto importante per evitare la formazione di legami disolfuro indesiderati durante la sintesi del peptide, perché può provocare una struttura completamente diversa del peptide e alterato di conseguenza bioattività. Tuttavia, la corretta formazione di ponti disolfuro multiple in un peptide è difficile da ottenere utilizzando metodi di auto-pieghevoli standard quali i protocolli di ossidazione convenzionale buffer, perché diverse connettività disolfuro può essere formato. Questo protocollo rappresenta una strategia avanzata necessaria per la sintesi mirata di più peptidi a ponte disolfuro che non possono essere sintetizzati tramite ossidazione di buffer in alta qualità e quantità. Lo studio dimostra l’applicazione di una strategia di gruppo protezione distinte per la sintesi di tutti gli isomeri possibili peptide 3-bisolfuro-legato di µ-conotossina PIIIA in modo mirato. I peptidi sono preparati di sintesi del peptide di fase solida Fmoc-based utilizzando una strategia di gruppo protezione per formazione di legami disolfuro definiti. Le rispettive coppie di cisteine sono protetti con trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) e tert-butilico (tBu) proteggere gruppi per assicurarsi che in ogni fase di ossidazione solo le cisteine richieste sono deprotetti e collegate. Oltre la sintesi mirata, una combinazione di diversi metodi analitici è utilizzata per chiarire il corretto folding e la generazione delle strutture del peptide desiderato. Indica il confronto tra i diversi isomeri 3-bisolfuro-legato l’importanza della determinazione accurata e conoscenza della connettività disolfuro per il calcolo della struttura tridimensionale e interpretazione del biologico attività degli isomeri del peptide. La caratterizzazione analitica comprende la delucidazione di legame disolfuro esatta tramite analisi di spettrometria di massa (MS/MS) tandem che viene eseguita con derivati parzialmente ridotti e alchilati di isomero peptide intatto prodotto da un protocollo adattato. Inoltre, le strutture del peptide sono determinate utilizzando esperimenti 2D a risonanza magnetica nucleare (NMR) e le conoscenze ottenute da analisi MS/MS.

Introduction

L’uso di peptidi bioattivi in farmaceutica ricerca e sviluppo è altamente riconosciuta, perché essi rappresentano composti potente e altamente selettivi per specifici bersagli biologici1. Per loro bioattività, tuttavia, la struttura tridimensionale è di grande importanza al fine di eseguire il rapporto struttura-attività studi2,3,4. A parte la sequenza di amminoacido primaria che influenza la conformazione generale, legami bisolfurico significativamente stabilizzano la struttura dei peptidi ricchi di cisteina5. Più peptidi a ponte disolfuro includono conotossine come µ-PIIIA da Conus purpurascens che contiene sei cisteine nella relativa sequenza. Questo contenuto di cisteina alta teoricamente permette la formazione di 15 isomeri di bisolfuro. La connettività di bisolfuro corretta è molto importante per l’attività biologica6,7. Tuttavia, la domanda che si pone è se c’è più di una conformazione bioattiva di peptidi naturali e se così, quale di questi isomeri possiede il più alta attività biologica? Nel caso di µ-conotossine, i bersagli biologici sono canali ionici voltaggio-dipendenti del sodio e µ-PIIIA, in particolare, è più potente per sottotipi NaV1.2, NaV1.4 e NaV1.73.

Sintesi di peptidi a ponte disolfuro può essere raggiunto utilizzando vari metodi. Il metodo più conveniente per la formazione di ponti disolfuro all’interno di un peptide è il cosiddetto approccio auto-folding ossidativo. Qui, il lineare precursore del peptide ciclico desiderato è sintetizzato utilizzando prima sintesi del peptide di fase solida, che è dopo la scissione dal supporto polimerico sottoposto ad ossidazione in un sistema tampone. Agenti redox-attivo come glutatione ridotto e ossidato (GSH/GSSG) vengono spesso aggiunti per promuovere la formazione dei legami disolfuro. Lo svantaggio principale di auto-buffer-supportato pieghevoli è che i legami disolfuro non si formano in modo selettivo ad un modo graduale. Rispetto al peptide nativo, per cui spesso isomero di un solo specifico disolfuro è descritto, è possibile ottenere numerosi altri isomeri con questo approccio8. µ-PIIIA ha già dimostrato di provocare almeno tre isomeri diversamente piegati su self-pieghevole in un precedente studio3. La separazione di una miscela di isomeri è piuttosto difficile a causa di tempi di ritenzione simili se utilizza metodi di purificazione cromatografica9. La sintesi mirata di un isomero specifico è pertanto vantaggiosa. A specificamente producono che un isomero con connettività di bisolfuro definiti, una strategia speciale è necessaria in cui obbligazioni al bisolfuro successivamente vengono chiusi. Pertanto, il precursore lineare che trasportano gruppi distinti di protezione presso le coppie singoli cisteina è sintetizzato il supporto di polimero. Dopo l’eliminazione, le coppie di cisteina sono individualmente e successivamente deprotetti e collegati in una reazione di ossidazione per produrre il desiderato bisolfuro obbligazioni10,11,12,13, 14 , 15 , 16. dopo la sintesi e la purificazione del prodotto di reazione, è necessario confermare l’identità e la connettività di bisolfuro di metodi analitici adatti. Numerosi metodi analitici sono disponibili per la delucidazione della sequenza primaria dell’amminoacido, ad es., MS/MS, mentre la determinazione della connettività bisolfuro rimane ancora molto meno studiata. A parte la complessità di tali peptidi multipli di bisolfuro-legato, impurità relative ai prodotti (ad es., da bisolfuro scrambling), a causa del campione preparazione e work-up può complicare ulteriormente analisi. In questa carta, indichiamo che l’uso di una combinazione di diverse tecniche analitiche è necessario chiarire in modo inequivocabile l’identità dei legami disolfuro negli isomeri µ-PIIIA. Abbiamo combinato i metodi cromatografici con spettrometria di massa e fornito gli stessi campioni di spettroscopia NMR. In matrix-assisted laser desorption/ionization(MALDI) analisi MS/MS, abbiamo identificato i legami disolfuro con riduzione parziale e iodoacetamide derivatizzazione in quanto analisi top-down non sono possibile per questo peptide. 2D NMR esperimenti sono stati eseguiti al fine di ottenere una struttura tridimensionale di ogni isomero. Così, combinando metodi analitici sofisticati distinti, è possibile chiarire correttamente la connettività di bisolfuro e la struttura tridimensionale del complesso più peptidi bisolfuro-legato7.

Protocol

Nota: Tutti gli amminoacidi utilizzati nel presente documento sono stati nella L-configurazione. Le abbreviazioni di aminoacidi e derivati di aminoacidi sono state utilizzate secondo le raccomandazioni del Comitato di IUB la nomenclatura e la Commissione congiunta di IUPAC-IUB sulla nomenclatura biochimica. 1. fase solida del Peptide sintesi (SPPS) Nota: Eseguire la sintesi con un sintetizzatore del peptide di fase solida. Eseguire la sintesi dei precursori del peptid…

Representative Results

15 diversi isomeri a ponte disolfuro di PIIIA il µ-conotossina sono sintetizzati e caratterizzati in dettaglio (Figura 1). I legami bisolfurico sono identificati da riduzione parziale e successiva analisi di MS/MS (Figura 2). Analisi NMR degli isomeri differenti avviene (Figura 3) per rivelare le strutture individuali del peptide. In particolare, una combinazione di RP HPLC, frammentazione MS/MS e N…

Discussion

Il metodo descritto nel presente documento per la sintesi di peptidi ricchi di cisteina come µ-PIIIA rappresenta una possibilità di produrre in modo selettivo gli isomeri bisolfuro-legato dalla stessa sequenza dell’amminoacido. Di conseguenza, stabilire metodi come solida base di Fmoc fase peptide sintesi18 e una strategia di gruppo protezione definita per la formazione regioselettiva di legami bisolfurico erano usati16. La sintesi peptidica in fase solida può produrre s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare r. Resemann, F. J. Mayer e D. Suckau da Bruker Daltonics GmbH di Brema; D. Tietze, r. r. Tietze, V. Schmidts e C. Thiele dal Politecnico di Darmstadt; O. Ohlenschläger dal FLI Jena, M. Engeser all’Università di Bonn; K. Kramer, r. Vortrieb e H. Nakagami dal Max Planck Institute for Plant Breeding Research, Colonia; Susanne Neupert dell’Istituto di zoologia, Colonia; e le strutture di spettroscopia di risonanza magnetica biomolecolari dell’Università di Francoforte per tecnico sostegno, moduli, di formazione e accesso agli strumenti. Sostegno finanziario all’Università di Bonn a D.I. si ringraziano.

Materials

Fmoc Rink amide resin Novabiochem 855001
Pyr(Boc) Bachem A-3850
Arg(Pbf) Iris Biotech FSC1010
Asn(Trt) Bachem B-1785
Asp(tBu) Iris Biotech FSP1020
Hyp(tBu) Iris Biotech FAA1627
Lys(Boc) Bachem B-1080
Ser(tBu) Iris Biotech FSC1190
Gln(Trt) Iris Biotech FSC1043
Glu(tBu) Iris Biotech FSP1045
Trp(Boc) Iris Biotech FSC1225
Tyr(tBu) Sigma Aldrich 47623
Thr(tBu) Iris Biotech FSP1210
His(Trt) Iris Biotech FDP1200
2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat Sigma Aldrich 8510060 Flammable
DMF Fisher Scientific D119 Flammable, Toxic
DCM Fisher Scientific D37 Carcinogenic
Piperidine Alfa Aesar A12442 Flammable, Toxic, Corrosive
N-Methyl-Morpholin Sigma Aldrich 224286
Cys(Acm) Iris Biotech FAA1506
Cys(Trt) Bachem E-2495
Cys(tBu) Bachem B-1220
trifluoruacetic acid Sigma Aldrich 74564 Toxic, Corrosive
phenol Merck 1002060 Toxic
thioanisol Alfa Aesar A14846
ethanedithiol Fluka Analytical 2390
diethyl ether VWR 100,921 Flammable
tert-butanol Alfa Aesar L12338 Flammable
acetonitrile Fisher Scientific A998 Flammable
water Fisher Scientific W5
isopropanol VWR ACRO42383 Flammable
sodium hydroxide AppliChem A6579,1000 Corrosive
iodoacetamide Sigma Aldrich I6125
iodine Sigma Aldrich I0385
Hydrochloric acid Merck 110165 Corrosive
ascorbic acid Sigma Aldrich A4403
diphenylsulfoxide Sigma Aldrich P35405
anisol Sigma Aldrich 96109 Flammable
trichloromethylsilane Sigma Aldrich M85301 Flammable
sample dilution buffer Laborservice Onken
sodium dihydrogen phosphate Sigma Aldrich 106370
disodium hydrogen phosphate Sigma Aldrich 795410
(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma Aldrich C4706
citric acid Sigma Aldrich 251275
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
tris-acetate Carl Roth,  7125
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma Aldrich E26282 
peptide calibration standard II Bruker Daltonics GmbH 8222570
Name of Equipment Company
solid-phase peptide synthesizer Intavis Bioanalytical Instruments AG EPS 221
lyophilizer  Martin Christ GmbH  Alpha 1-2 Ldplus
semipreparative HPLC Jasco system PV-987
Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) Knauer 25QE181E2J purification of the linear peptide
Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) Hichrom-VWR HICH218TP1022 purification of the oxidized peptide
analytical HPLC  Shimadzu system LC-20AD
Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm)  Hichrom-VWR HICH218TP54 analytical column
ground steel target (MTP 384) Bruker Daltonics GmbH NC0910436 MALDI preparation 
C18-concentration filter (ZipTip) Merck KGaA ZTC18S096 MALDI preparation 
MALDI mass spectrometer Bruker Daltonics GmbH ultraflex III TOF/TOF
amino acid analyzer Eppendorf-Biotronik GmbH LC 3000 system
NMR spectrometer Bruker Avance III Bruker Daltonics GmbH Bruker Avance III 600 MHz
computer program for molecular visualising YASARA Biosciences GmbH Yasara structures NMR structure calculation
computer program for MALDI data evaluation  Bruker Daltonics GmbH flexAnalysis, BioTools MS/MS fragmentation
analog vortex mixer VWR VM 3000
Microcentrifuge Eppendorf 5410
Centrifuge Hettich EBA 20
Rotational vacuum concentrator Christ 2-18 Cdplus
Analytical Balance A&D Instruments GR-202-EC

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Cite This Article
Heimer, P., Schmitz, T., Bäuml, C. A., Imhof, D. Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. J. Vis. Exp. (140), e58368, doi:10.3791/58368 (2018).

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