Sintesi e determinazione della struttura di µ-conotossina PIIIA isomeri con bisolfuro diverse connettività

L’uso di peptidi bioattivi in farmaceutica ricerca e sviluppo è altamente riconosciuta, perché essi rappresentano composti potente e altamente selettivi per specifici bersagli biologici¹. Per loro bioattività, tuttavia, la struttura tridimensionale è di grande importanza al fine di eseguire il rapporto struttura-attività studi^2,3,4. A parte la sequenza di amminoacido primaria che influenza la conformazione generale, legami bisolfurico significativamente stabilizzano la struttura dei peptidi ricchi di cisteina⁵. Più peptidi a ponte disolfuro includono conotossine come µ-PIIIA da Conus purpurascens che contiene sei cisteine nella relativa sequenza. Questo contenuto di cisteina alta teoricamente permette la formazione di 15 isomeri di bisolfuro. La connettività di bisolfuro corretta è molto importante per l’attività biologica^6,7. Tuttavia, la domanda che si pone è se c’è più di una conformazione bioattiva di peptidi naturali e se così, quale di questi isomeri possiede il più alta attività biologica? Nel caso di µ-conotossine, i bersagli biologici sono canali ionici voltaggio-dipendenti del sodio e µ-PIIIA, in particolare, è più potente per sottotipi Na_V1.2, Na_V1.4 e Na_V1.7³.

Sintesi di peptidi a ponte disolfuro può essere raggiunto utilizzando vari metodi. Il metodo più conveniente per la formazione di ponti disolfuro all’interno di un peptide è il cosiddetto approccio auto-folding ossidativo. Qui, il lineare precursore del peptide ciclico desiderato è sintetizzato utilizzando prima sintesi del peptide di fase solida, che è dopo la scissione dal supporto polimerico sottoposto ad ossidazione in un sistema tampone. Agenti redox-attivo come glutatione ridotto e ossidato (GSH/GSSG) vengono spesso aggiunti per promuovere la formazione dei legami disolfuro. Lo svantaggio principale di auto-buffer-supportato pieghevoli è che i legami disolfuro non si formano in modo selettivo ad un modo graduale. Rispetto al peptide nativo, per cui spesso isomero di un solo specifico disolfuro è descritto, è possibile ottenere numerosi altri isomeri con questo approccio⁸. µ-PIIIA ha già dimostrato di provocare almeno tre isomeri diversamente piegati su self-pieghevole in un precedente studio³. La separazione di una miscela di isomeri è piuttosto difficile a causa di tempi di ritenzione simili se utilizza metodi di purificazione cromatografica⁹. La sintesi mirata di un isomero specifico è pertanto vantaggiosa. A specificamente producono che un isomero con connettività di bisolfuro definiti, una strategia speciale è necessaria in cui obbligazioni al bisolfuro successivamente vengono chiusi. Pertanto, il precursore lineare che trasportano gruppi distinti di protezione presso le coppie singoli cisteina è sintetizzato il supporto di polimero. Dopo l’eliminazione, le coppie di cisteina sono individualmente e successivamente deprotetti e collegati in una reazione di ossidazione per produrre il desiderato bisolfuro obbligazioni^{10,11,12,13, 14 , 15 , 16}. dopo la sintesi e la purificazione del prodotto di reazione, è necessario confermare l’identità e la connettività di bisolfuro di metodi analitici adatti. Numerosi metodi analitici sono disponibili per la delucidazione della sequenza primaria dell’amminoacido, ad es., MS/MS, mentre la determinazione della connettività bisolfuro rimane ancora molto meno studiata. A parte la complessità di tali peptidi multipli di bisolfuro-legato, impurità relative ai prodotti (ad es., da bisolfuro scrambling), a causa del campione preparazione e work-up può complicare ulteriormente analisi. In questa carta, indichiamo che l’uso di una combinazione di diverse tecniche analitiche è necessario chiarire in modo inequivocabile l’identità dei legami disolfuro negli isomeri µ-PIIIA. Abbiamo combinato i metodi cromatografici con spettrometria di massa e fornito gli stessi campioni di spettroscopia NMR. In matrix-assisted laser desorption/ionization(MALDI) analisi MS/MS, abbiamo identificato i legami disolfuro con riduzione parziale e iodoacetamide derivatizzazione in quanto analisi top-down non sono possibile per questo peptide. 2D NMR esperimenti sono stati eseguiti al fine di ottenere una struttura tridimensionale di ogni isomero. Così, combinando metodi analitici sofisticati distinti, è possibile chiarire correttamente la connettività di bisolfuro e la struttura tridimensionale del complesso più peptidi bisolfuro-legato⁷.