Summary

Synthese und Strukturaufklärung von µ-vor PIIIA Isomere mit verschiedenen Disulfid Verschaltungen

Published: October 02, 2018
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Summary

Cystein-Rich-Peptide Falten in verschiedene dreidimensionale Strukturen abhängig von ihrer Disulfid-Konnektivität. Gezielte Synthese von einzelnen Disulfid Isomere ist erforderlich, wenn Puffer Oxidation nicht zu dem gewünschten Disulfid-Konnektivität führt. Das Protokoll geht es um die selektive Synthese von 3-Disulfid-gebundenen Peptide und ihre strukturellen Analyse mit NMR und MS/MS-Studien.

Abstract

Peptide mit einer hohen Anzahl von Cysteine werden in der Regel über die dreidimensionale Struktur von ihrer Disulfid-Konnektivität beeinflusst. Es ist somit sehr wichtig, um unerwünschte Disulfid Bindung Bildung bei der Peptidsynthese zu vermeiden, da es ein ganz anderes Peptid-Struktur führen kann und damit veränderte Bioaktivität. Die korrekte Bildung von Mehrfachbindungen Disulfid in ein Peptid ist jedoch schwer zu bekommen mit selbst Falten Standardmethoden wie konventionelle Puffer Oxidation Protokolle, weil mehrere Disulfid Verschaltungen gebildet werden können. Dieses Protokoll stellt eine erweiterte Strategie für die gezielte Synthese von mehreren Disulfid überbrückt Peptide, die durch Oxidation der Puffer in hoher Qualität und Quantität synthetisiert werden kann nicht erforderlich. Die Studie zeigt die Anwendung eine deutliche schützende Gruppe Strategie für die Synthese von allen möglichen 3-Disulfid-gebundenen Peptid Isomere von µ-vor PIIIA gezielt. Die Peptide werden von Fmoc-basierte Festphasen-Peptidsynthese mit einer schützenden Strategie für definierte Disulfid Bindung Bildung vorbereitet. Die jeweiligen Paare von Cysteine sind geschützt mit Trityl (Trt), Acetamidomethyl (Acm) und Tert-Butyl (tBu) Schutz Gruppen um sicherzustellen, dass während jeder Oxidationsschritt nur die erforderlichen Cysteine deprotected und verknüpft sind. Neben der gezielten Synthese ist eine Kombination von mehreren analytischen Methoden verwendet, um die korrekte Faltung und Erzeugung von das gewünschte Peptid-Strukturen zu klären. Der Vergleich der verschiedenen 3-Disulfid-gebundenen Isomeren zeigt, wie wichtig es ist, dass genaue Bestimmung und Wissen über die Disulfid-Konnektivität für die Berechnung der dreidimensionalen Struktur und für die Interpretation der biologischen Aktivität der Peptid-Isomeren. Die analytische Charakterisierung beinhaltet die genaue Disulfid Bindung Aufklärung über Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS)-Analyse, die mit teilweise reduziert und alkyliert Derivate von der intakten Peptid-Isomer produziert durch eine angepasste Protokoll durchgeführt wird. Darüber hinaus werden die Peptid-Strukturen mit 2D Kernspinresonanz (NMR) Experimente und das Wissen aus der MS/MS-Analyse bestimmt.

Introduction

Die Verwendung von bioaktiven Peptiden in der pharmazeutischen Forschung und Entwicklung ist hoch anerkannt, weil sie potente und hoch selektive Verbindungen für bestimmte biologische Ziele1darstellen. Für ihre Bioaktivität ist jedoch die dreidimensionale Struktur von großer Bedeutung um Struktur-Aktivitäts-Beziehungen Studien2,3,4durchzuführen. Neben der primären Aminosäure-Sequenz, die die gesamte Konformation beeinflusst, stabilisieren Disulfid Anleihen deutlich die Struktur der Cystein-Rich-Peptide5. Mehreren Disulfid überbrückt Peptide enthalten Conotoxine wie µ-PIIIA von Conus Purpurascens die sechs Cysteine in seiner Sequenz enthält. Diese hohe Cystein-Inhalte ermöglicht theoretisch die Bildung von 15 Disulfid-Isomere. Die richtige Disulfid-Konnektivität ist sehr wichtig für die biologische Aktivität6,7. Allerdings ist stellt sich die Frage, ob gibt es mehrere bioaktive Konformation des natürlich vorkommenden Peptide und wenn so, welche diese Isomere die höchste biologische Aktivität besitzt? Bei µ-Conotoxine, sind die biologischen Zielen Voltage-gated Natrium-Ionenkanäle und µ-PIIIA ist insbesondere für UntertypenV1.2, Na Na stärksteV1.4 und NaV1.73.

Die Synthese von Peptiden Disulfid überbrückt kann mit verschiedenen Methoden erreicht werden. Die praktischste Methode für die Bildung von Disulfid-Bindungen innerhalb ein Peptid ist der sogenannte oxidative selbst Falten Ansatz. Hier wird die lineare Vorläufer des gewünschten zyklische Peptid synthetisiert zuerst mit Festphasen-Peptidsynthese, die nach die Spaltung von Polymeren Unterstützung Oxidation in einem Puffersystem unterworfen. Redox-aktiven Substanzen wie reduzierte und oxidierte Glutathion (GSH/GSSG) werden häufig hinzugefügt, um die Bildung von Disulfid-Bindungen zu fördern. Der größte Nachteil der Puffer unterstützt Self Faltung ist, dass die Disulfid-Bindungen nicht selektiv in einer schrittweisen Weise gebildet werden. Im Vergleich zu nativen Peptid, bei dem oft nur eine bestimmte Disulfid Isomer beschrieben wird, ist es möglich, zahlreiche andere Isomere mit diesem Ansatz8zu erhalten. µ-PIIIA nachweislich bereits mindestens drei unterschiedlich gefaltet Isomere auf selbst in einer früheren Studie3Falten führen. Die Trennung von solch ein Isomer Mischung ist eher schwierig, da ähnliche Retentionszeiten, wenn chromatographische Reinigung Methoden9verwenden. Die gezielte Synthese von spezifischen Isomer ist daher vorteilhaft. Insbesondere Produkte, die ein Isomer mit definierten Disulfid-Konnektivität, eine besondere Strategie erforderlich ist, in denen das Disulfid Anleihen werden sukzessive geschlossen. Daher ist der lineare Vorläufer tragen verschiedene Schutzgruppen auf die einzelnen Cystein-Paare auf die Polymer-Unterstützung synthetisiert. Nach der Beseitigung der Cystein-Paare sind einzeln und nacheinander deprotected und verknüpft in eine Oxidationsreaktion zu der gewünschten Disulfid Anleihen10,11,12,13, 14 , 15 , 16. nach der Synthese und der Reinigung des reaktionsproduktes, es ist verpflichtet, die Identität und die Disulfid-Konnektivität bestätigen durch geeignete analytische Methoden. Zahlreiche analytische Methoden stehen zur Verfügung für die Aufklärung der primären Aminosäuresequenz, zB., MS/MS, während die Bestimmung der Disulfid-Konnektivität noch viel weniger untersuchten bleibt. Abgesehen von der Komplexität der solche mehrere Disulfid-gebundenen Peptide, produktbezogene Verunreinigungen (zB., von Disulfid kriechen), aufgrund der Probe Vorbereitung und Aufarbeitung können weiter zu komplizieren Analyse. In diesem Beitrag zeigen wir, dass die Verwendung einer Kombination von verschiedenen analytischen Techniken notwendig ist, die Identität der Disulfid Anleihen in der µ-PIIIA Isomere eindeutig zu klären. Wir haben Chromatographische Methoden mit Massenspektrometrie kombiniert und die gleichen Proben, NMR-Spektroskopie. In Matrix-unterstützte Laser desorption/ionization(MALDI) MS/MS-Analyse haben wir die Disulfid-Bindungen mit teilweiser Abbau und Iodoacetamide Derivatisierung, weil Top-Down-Analyse nicht möglich, dass dieses Peptid ist identifiziert. 2D NMR-Experimente wurden durchgeführt, um eine dreidimensionale Struktur jedes Isomer zu erhalten. So kann es durch die Kombination von verschiedenen anspruchsvollen Analysemethoden, richtig die Disulfid-Konnektivität und die dreidimensionale Struktur des Komplexes mehrere Disulfid-gebundenen Peptide7aufzuklären.

Protocol

Hinweis: Alle hierin verwendeten Aminosäuren wurden in der L-Konfiguration. Die Abkürzungen von Aminosäuren und Aminosäure-Derivate wurden entsprechend den Empfehlungen der Nomenklatur Ausschuss der IUB und die IUPAC-IUB Joint Commission on biochemische Nomenklatur verwendet. (1) Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) Hinweis: Führen Sie die Synthese mit einem Festphasen-Peptid-Synthesizer. Führen Sie die Synthese von linearen Peptid Vorläufer der allgemeinen Sequenz…

Representative Results

15 verschiedene Disulfid überbrückt Isomere von µ-vor PIIIA synthetisiert und charakterisiert im Detail (Abbildung 1). Disulfid-Bindungen sind mit teilweiser Abbau und MS/MS-Analyse (Abbildung 2) gekennzeichnet. NMR-Analyse der verschiedenen Isomeren erfolgt (Abbildung 3), um die einzelnen Peptid-Strukturen zu offenbaren. Insbesondere ist eine Kombination aus RP-HPLC, MS/MS-Fragmentierung und NMR-…

Discussion

Die Methode, die hier beschriebenen für die Synthese von Cystein-Rich-Peptide wie µ-PIIIA stellt eine Möglichkeit, selektiv Disulfid-gebundenen Isomere von der gleichen Aminosäuresequenz zu produzieren. Daher etablierte Methoden wie Fmoc-basierten Solid phase Peptid-Synthese-18 und eine definierten Schutz Strategie für die Regioselective Bildung von Disulfid-Bindungen wurden gebrauchte16. Die Festphasen-Peptidsynthese kann Aminosäure-Sequenzen auf einem Polymer-Träge…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten danken A. Resemann, F. J. Mayer und D. Suckau von Bruker Daltonics GmbH Bremen; D. Tietze, A. A. Tietze, V. Schmidts und C. Thiele von der technischen Universität Darmstadt; O. Ohlenschläger der FLI Jena, M. Engeser an der Universität Bonn; K. Kramer, A. Wertung und H. Nakagami vom Max-Planck-Institut für Züchtungsforschung, Köln; Susanne Neupert vom Institut für Zoologie, Köln; und Biomolekulare Magnetresonanz-Spektroskopie Einrichtungen der Universität Frankfurt für technische Unterstützung, Ausbildungsmodule, und Zugang zu Instrumenten. Finanzieller Unterstützung von der Universität Bonn, D.I. wird dankbar anerkannt.

Materials

Fmoc Rink amide resin Novabiochem 855001
Pyr(Boc) Bachem A-3850
Arg(Pbf) Iris Biotech FSC1010
Asn(Trt) Bachem B-1785
Asp(tBu) Iris Biotech FSP1020
Hyp(tBu) Iris Biotech FAA1627
Lys(Boc) Bachem B-1080
Ser(tBu) Iris Biotech FSC1190
Gln(Trt) Iris Biotech FSC1043
Glu(tBu) Iris Biotech FSP1045
Trp(Boc) Iris Biotech FSC1225
Tyr(tBu) Sigma Aldrich 47623
Thr(tBu) Iris Biotech FSP1210
His(Trt) Iris Biotech FDP1200
2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat Sigma Aldrich 8510060 Flammable
DMF Fisher Scientific D119 Flammable, Toxic
DCM Fisher Scientific D37 Carcinogenic
Piperidine Alfa Aesar A12442 Flammable, Toxic, Corrosive
N-Methyl-Morpholin Sigma Aldrich 224286
Cys(Acm) Iris Biotech FAA1506
Cys(Trt) Bachem E-2495
Cys(tBu) Bachem B-1220
trifluoruacetic acid Sigma Aldrich 74564 Toxic, Corrosive
phenol Merck 1002060 Toxic
thioanisol Alfa Aesar A14846
ethanedithiol Fluka Analytical 2390
diethyl ether VWR 100,921 Flammable
tert-butanol Alfa Aesar L12338 Flammable
acetonitrile Fisher Scientific A998 Flammable
water Fisher Scientific W5
isopropanol VWR ACRO42383 Flammable
sodium hydroxide AppliChem A6579,1000 Corrosive
iodoacetamide Sigma Aldrich I6125
iodine Sigma Aldrich I0385
Hydrochloric acid Merck 110165 Corrosive
ascorbic acid Sigma Aldrich A4403
diphenylsulfoxide Sigma Aldrich P35405
anisol Sigma Aldrich 96109 Flammable
trichloromethylsilane Sigma Aldrich M85301 Flammable
sample dilution buffer Laborservice Onken
sodium dihydrogen phosphate Sigma Aldrich 106370
disodium hydrogen phosphate Sigma Aldrich 795410
(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma Aldrich C4706
citric acid Sigma Aldrich 251275
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
tris-acetate Carl Roth,  7125
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma Aldrich E26282 
peptide calibration standard II Bruker Daltonics GmbH 8222570
Name of Equipment Company
solid-phase peptide synthesizer Intavis Bioanalytical Instruments AG EPS 221
lyophilizer  Martin Christ GmbH  Alpha 1-2 Ldplus
semipreparative HPLC Jasco system PV-987
Eurospher 100 C18 column (RP, 5 µm particle size, 100 Å pore size, 250 x 32 mm) Knauer 25QE181E2J purification of the linear peptide
Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 22 mm) Hichrom-VWR HICH218TP1022 purification of the oxidized peptide
analytical HPLC  Shimadzu system LC-20AD
Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 µm particle size, 300 Å pore size, 250 x 4.6 mm)  Hichrom-VWR HICH218TP54 analytical column
ground steel target (MTP 384) Bruker Daltonics GmbH NC0910436 MALDI preparation 
C18-concentration filter (ZipTip) Merck KGaA ZTC18S096 MALDI preparation 
MALDI mass spectrometer Bruker Daltonics GmbH ultraflex III TOF/TOF
amino acid analyzer Eppendorf-Biotronik GmbH LC 3000 system
NMR spectrometer Bruker Avance III Bruker Daltonics GmbH Bruker Avance III 600 MHz
computer program for molecular visualising YASARA Biosciences GmbH Yasara structures NMR structure calculation
computer program for MALDI data evaluation  Bruker Daltonics GmbH flexAnalysis, BioTools MS/MS fragmentation
analog vortex mixer VWR VM 3000
Microcentrifuge Eppendorf 5410
Centrifuge Hettich EBA 20
Rotational vacuum concentrator Christ 2-18 Cdplus
Analytical Balance A&D Instruments GR-202-EC

References

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Cite This Article
Heimer, P., Schmitz, T., Bäuml, C. A., Imhof, D. Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. J. Vis. Exp. (140), e58368, doi:10.3791/58368 (2018).

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