Synthese und Strukturaufklärung von µ-vor PIIIA Isomere mit verschiedenen Disulfid Verschaltungen

Die Verwendung von bioaktiven Peptiden in der pharmazeutischen Forschung und Entwicklung ist hoch anerkannt, weil sie potente und hoch selektive Verbindungen für bestimmte biologische Ziele¹darstellen. Für ihre Bioaktivität ist jedoch die dreidimensionale Struktur von großer Bedeutung um Struktur-Aktivitäts-Beziehungen Studien^2,3,4durchzuführen. Neben der primären Aminosäure-Sequenz, die die gesamte Konformation beeinflusst, stabilisieren Disulfid Anleihen deutlich die Struktur der Cystein-Rich-Peptide⁵. Mehreren Disulfid überbrückt Peptide enthalten Conotoxine wie µ-PIIIA von Conus Purpurascens die sechs Cysteine in seiner Sequenz enthält. Diese hohe Cystein-Inhalte ermöglicht theoretisch die Bildung von 15 Disulfid-Isomere. Die richtige Disulfid-Konnektivität ist sehr wichtig für die biologische Aktivität^6,7. Allerdings ist stellt sich die Frage, ob gibt es mehrere bioaktive Konformation des natürlich vorkommenden Peptide und wenn so, welche diese Isomere die höchste biologische Aktivität besitzt? Bei µ-Conotoxine, sind die biologischen Zielen Voltage-gated Natrium-Ionenkanäle und µ-PIIIA ist insbesondere für Untertypen_V1.2, Na Na stärkste_V1.4 und Na_V1.7³.

Die Synthese von Peptiden Disulfid überbrückt kann mit verschiedenen Methoden erreicht werden. Die praktischste Methode für die Bildung von Disulfid-Bindungen innerhalb ein Peptid ist der sogenannte oxidative selbst Falten Ansatz. Hier wird die lineare Vorläufer des gewünschten zyklische Peptid synthetisiert zuerst mit Festphasen-Peptidsynthese, die nach die Spaltung von Polymeren Unterstützung Oxidation in einem Puffersystem unterworfen. Redox-aktiven Substanzen wie reduzierte und oxidierte Glutathion (GSH/GSSG) werden häufig hinzugefügt, um die Bildung von Disulfid-Bindungen zu fördern. Der größte Nachteil der Puffer unterstützt Self Faltung ist, dass die Disulfid-Bindungen nicht selektiv in einer schrittweisen Weise gebildet werden. Im Vergleich zu nativen Peptid, bei dem oft nur eine bestimmte Disulfid Isomer beschrieben wird, ist es möglich, zahlreiche andere Isomere mit diesem Ansatz⁸zu erhalten. µ-PIIIA nachweislich bereits mindestens drei unterschiedlich gefaltet Isomere auf selbst in einer früheren Studie³Falten führen. Die Trennung von solch ein Isomer Mischung ist eher schwierig, da ähnliche Retentionszeiten, wenn chromatographische Reinigung Methoden⁹verwenden. Die gezielte Synthese von spezifischen Isomer ist daher vorteilhaft. Insbesondere Produkte, die ein Isomer mit definierten Disulfid-Konnektivität, eine besondere Strategie erforderlich ist, in denen das Disulfid Anleihen werden sukzessive geschlossen. Daher ist der lineare Vorläufer tragen verschiedene Schutzgruppen auf die einzelnen Cystein-Paare auf die Polymer-Unterstützung synthetisiert. Nach der Beseitigung der Cystein-Paare sind einzeln und nacheinander deprotected und verknüpft in eine Oxidationsreaktion zu der gewünschten Disulfid Anleihen^{10,11,12,13, 14 , 15 , 16}. nach der Synthese und der Reinigung des reaktionsproduktes, es ist verpflichtet, die Identität und die Disulfid-Konnektivität bestätigen durch geeignete analytische Methoden. Zahlreiche analytische Methoden stehen zur Verfügung für die Aufklärung der primären Aminosäuresequenz, zB., MS/MS, während die Bestimmung der Disulfid-Konnektivität noch viel weniger untersuchten bleibt. Abgesehen von der Komplexität der solche mehrere Disulfid-gebundenen Peptide, produktbezogene Verunreinigungen (zB., von Disulfid kriechen), aufgrund der Probe Vorbereitung und Aufarbeitung können weiter zu komplizieren Analyse. In diesem Beitrag zeigen wir, dass die Verwendung einer Kombination von verschiedenen analytischen Techniken notwendig ist, die Identität der Disulfid Anleihen in der µ-PIIIA Isomere eindeutig zu klären. Wir haben Chromatographische Methoden mit Massenspektrometrie kombiniert und die gleichen Proben, NMR-Spektroskopie. In Matrix-unterstützte Laser desorption/ionization(MALDI) MS/MS-Analyse haben wir die Disulfid-Bindungen mit teilweiser Abbau und Iodoacetamide Derivatisierung, weil Top-Down-Analyse nicht möglich, dass dieses Peptid ist identifiziert. 2D NMR-Experimente wurden durchgeführt, um eine dreidimensionale Struktur jedes Isomer zu erhalten. So kann es durch die Kombination von verschiedenen anspruchsvollen Analysemethoden, richtig die Disulfid-Konnektivität und die dreidimensionale Struktur des Komplexes mehrere Disulfid-gebundenen Peptide⁷aufzuklären.