JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Полуавтоматическое производство гепатоцитов как клетки от плюрипотентных стволовых клеток

Published: July 27, 2018
doi:
10.3791/57995
, , ,
1MRC Centre for Regenerative Medicine,University of Edinburgh

Summary

Этот протокол описывает полуавтоматического подхода производить гепатоцито подобных клеток от человеческих плюрипотентных стволовых клеток в 96 пластина хорошо формате. Этот процесс является быстрое и экономичное, позволяя производство качества заверил партий гепатоцито подобных клеток для фундаментальных и прикладных исследований человеческого.

Abstract

Человеческих плюрипотентных стволовых клеток представляют собой возобновляемый источник человеческой ткани. Наши исследования сосредоточены на создании человеческой ткани печени из человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs). Нынешние процедуры дифференциация генерировать отображение смесь черты плода и взрослых клеток человека гепатоцито как (кг). Для улучшения фенотипа клетки, мы полностью определили наши процедуры дифференциации и ниша клеток, что приводит к генерации клеточных популяций, которые показывают улучшение гена экспрессия и фукнции. Хотя эти исследования отмечают прогресс, способность генерировать большое количество хорошо multi пластины для скрининга было ограничено труда интенсивные процедуры и вариации партии к партии. Для решения этой проблемы, мы разработали платформу полуавтоматические дифференцироваться плюрипотентных стволовых клеток в кг. стволовых клеток посева и дифференциации были проведены с использованием жидкого обработки и автоматических систем дозирования в формат 96-луночных пластины. После дифференциации фенотипа клетки были проанализированы с использованием автоматизированных микроскопии и хорошо Люминометр multi.

Introduction

Первичного человека гепатоцитов (PHHs) представляют текущий стандарт для печени биомедицинских исследований. Несмотря на свои преимущества PHHs представляют собой ограниченный источник зрелых гепатоцитов с нестабильной фенотип1. Человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) были предложены как мощный ресурс для биомедицинских исследований, обещая возобновляемый источник человеческой ткани, в том числе печени2,3,4 . Нынешние процедуры дифференциация гепатоцитов генерировать клетки, которые выражают гепатоцитов маркеров, генов и функции, аналогичные PHHs3,4,5,6,7, 8,9,10,11. Совсем недавно использование определенных материалов и матрицы например рекомбинантных laminins, имеет улучшение клеток фенотипа и экспериментальной воспроизводимость5,12,,1314.

Традиционные клеточные культуры технологии полагаются на Ручное дозирование, который является как времени, так и ошибкам. Это ограничивает пропускную способность пробирного и пластины формат, который может работать с. На сегодняшний день, большинство исследований, описывающих поколения кг являются трудоемкий характер и поэтому малого масштаба в размер15,16,17.

Текущие достижения в жидкой обработке и дозирования систем, в сочетании с автоматизированной микроскопии и лабораторных анализаторов, позволили разработать процедуры, которые минимизируют необходимость вмешательства человека. Мы воспользовались этих технологий и разработал систему полуавтоматической дифференциации с которым для создания большого количества человеческой ткани печени для basic и прикладных биомедицинских исследований. Этот подход может выполняться с человека ESC и iPSC линии с незначительными изменениями необходимыми, в зависимости от линии клеток. Сочетание этой системы с высоким контент-анализа, мы демонстрируем, что фенотип HLC может быть меньше времени и осуществляется в масштабе18,19,,2021.

В целом автоматизации методы культуры клетки описаного привело к улучшения в надежности, экспериментальный время управления и пробирного пропускную способность.

Protocol

1. Заполнение человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) в 96 хорошо пластины для гепатоцитов дифференциация Примечание: Реагенты и оборудование, используемые в настоящем протоколе были перечислены в таблице 1. СМИ, используемые для этого эксперимента должны быть стерильным и при комнатной температуре на культуры клеток. Все тома реагент/решения, описанные в этой части протокола основаны на один колодец 96-луночных плиты, если не указано иное. Подготовить Ламинин покрытием 96 хорошо пластины. Оттепель флакон рекомбинантных Ламинин 521 (100 мкг/мл) (LN-521) за 2 ч до на ночь при 4 ° C. Подготовьте 5 мкг/мл раствора путем разбавления LN-521 в ледяной 1 x Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS) (с Ca2 +/Mg2 +). Используйте автоматическое жидкость, обработка распылитель с стандартной трубки подачи кассеты для 50 мкл раствора LN-521 на хорошо 96 хорошо плиты.Примечание: Все тома распределяет выполняются с автоматической обработки жидких распылитель с стандартной трубки подачи кассеты, если не указано иное. Простое решение до тех пор, пока он достигает дозирования конца кассеты, а затем приступить к обойтись. Несколько 96 хорошо пластины можно приготовить в же эксперименте, повторяя процедуру как столько раз, сколько необходимо. Инкубируйте пластины с покрытием LN521 37 °C/5% CO2 на 2-4 ч.Примечание: LN521-покрытием пластин может храниться до двух недель при 4 ° C. Держите пластины, опечатали на ровной поверхности, чтобы избежать испарения и загрязнения. Разминка требуемое количество предварительно покрытых пластин при 37 ° C за 30 мин до 1 часа. Аспирационная оставшийся раствор LN-521 с покрытием поверхности, с помощью адаптера 8-канальный аспирации.Примечание: Важно избегать любых контактов с покрытием поверхности, чтобы избежать деградации покрытие. Немедленно добавьте 50 мкл на хорошо mTeSR1 среды с 10 мкм Ро связанные киназы (рок) ингибитор Y27632 и держать пластину в инкубаторе до ячейки высев на 37 °C/5% CO2.Примечание: Не позволяют Ламинин покрытием скважин для просушки. Готовят суспензию клеток 3 x 105 клеток/мл в mTeSR1 среде с 10 мкм рок ингибитор Y27632.Примечание: Плотность посева для каждой ячейки строки потребует оптимизации. Аспирационная средство от Петри с недифференцированными культуры hPSCs на около 75% до 85% confluency, культивируемых на LN-521 как описано12.Примечание: hPSCs культивированный на LN-521 mTSER1 с средой изменили каждые 24 ч и пассированной регулярно после того, как клетки достигает 80% confluency как описано12. Вымыть клетки с 5 мл комнатной температуры 1 x DPBS (без Ca2 +/Mg2 +) и аспирата буфера. Добавьте 5 мл 1 x нежный реагент диссоциации клеток в клетки и инкубировать при 37 ° C для 6-8 мин для диссоциации клеток.Примечание: Чтобы остановить реакции, изучите отряд клетки от матрицы под микроскопом. Клетки должны быть частично отделен от пластины. Если нет, то продлить инкубации для дополнительных 1-2 мин. Прекратить реакции, аспирационных нежный диссоциации клеток реагента и добавьте 5 мл свежего mTeSR1 среды с 10 мкм рок ингибитор Y27632 к клеткам. Используйте скребок ячейки поднять клетки от матрицы и пипетки вверх и вниз с помощью кончика P1000 несколько раз перемешать. Количество жизнеспособных клеток с помощью Горяева, основанный на Трипановый синий окрашивания методом исключения и готовят суспензию клеток с необходимые концентрации. Пипетка нужное количество клеток в стерильных пластиковых пробирок 15 мл или 50 мл и уменьшается клетки центрифугированием их на 115 x g 5 мин при комнатной температуре.Примечание: Для одной 96 хорошо пластины, 5 мл mTeSR1 среды, содержащие 3 x 105 клеток/мл требуется для линии клеток H9. Аспирационная супернатант и нежно ресуспензируйте Пелле клеток до получения однородного раствора при 37 ° C в mTeSR1 среде с 10 мкм рок ингибитор Y27632.Примечание: Как она улучшает ячейки выживания должность повторно покрытие рекомендуется использовать ингибитора рок. Добавьте 50 мкл суспензии клеток на 96 хорошо пластину, содержащие 50 мкл mTeSR1 с 10 мкм рок ингибитор Y27632. После посева, возвращение пластины в ячейку инкубатора 37 °C/5% CO2 на 24 часа позволить клетки для присоединения. Изучить клетки следующий день и вывести рок ингибитор, после того, как был создан контакт к ячейке. На 40% confluency переключитесь на дифференциации среднего (рис. 1B).Примечание: Если ячейка confluency выше, чем на 40%, плит не подходят для дифференциации HLC с линией клеток H9. 2. дифференциация hPSCs гепатоцито подобных клеток на рекомбинантной Laminins в 96 хорошо пластины Подготовьте дифференциации среднего и роста факторов. Подготовьте человека Activin A Стоковый раствор (100 мкг/мл), растворяя человека Activin A порошок в стерильных 0,2% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS. Алиготе запас и хранить при температуре от-20 ° C. Использование 1:1, 000. Подготовьте раствор мыши Wnt3a (10 мкг/мл) путем растворения порошка Wnt3a мыши в стерильных 0,2% BSA. Алиготе запас и хранить при температуре от-20 ° C. Используйте 1: 200. Подготовьте раствор человеческого гепатоцитов фактор роста (HGF) (10 мкг/мл), растворяя человека HGF порошок в стерильных 0,2% BSA. Алиготе запас и хранить при температуре от-20 ° C. Используйте 1: 1000. Подготовьте раствор (20 мкг/мл) Oncostatin М (OSM) путем растворения порошка в стерильных 0,2% BSA. Алиготе запас и хранить при температуре от-20 ° C. Использование 1:1, 000. Окончательное энтодермы: подготовить энтодермы дифференциации среднего, состоящий из 2% B27 дополнения (50 x, без инсулина), 1% пенициллина/стрептомицина (окончательный концентрации: 100 МЕ/мл и 100 мкг/мл, соответственно) добавлены в Розуэлле парк Мемориальный институт 1640 ( RPMI 1640) базальной среднего. Хранить при 4 ° C и использовать в течение двух недель. При каждом изменении среднего дополнение необходимый объем с Activin и Wnt3a в конечной концентрации 100 нг/мл и 50 нг/мл, соответственно. Hepatoblast дифференциация: подготовка hepatoblast дифференциация среде, состоящей из 20% нокаутом сыворотки замены (KSR), 0,5% альтернативу дополнение к L-глютамин, 1% несущественные аминокислот (NEAA), бета меркаптоэтанол 0,1 мм, 1% ДМСО и 1% пенициллин/стрептомицина (окончательный концентрации на 100 МЕ/мл и 100 мкг/мл, соответственно) добавлен в нокаут DMEM (KO-DMEM). Фильтр под вакуумом и хранить при 4 ° C. Использовать в течение двух недель. Гепатоцит дифференциация: подготовить гепатоцитов дифференциации среднего, состоящий из 1% альтернативу дополнение к L-глютамином, 10 мкм гидрокортизон 21-hemisuccinate натриевая соль (HCC), 1% пенициллина/стрептомицина (окончательный концентрации на 100 МЕ/мл и 100 мкг/мл, соответственно) добавлены к HepatoZYME среде. Хранить запас на 4 ° C и использовать в течение двух недель. Для каждого среднего изменения, дополнения необходимый объем с HGF и OSM (окончательный концентрации на 10 нг/мл и 20 нг/мл, соответственно). 24 h посева, тщательно удалить средство, с помощью системы Дозатор автоматический ручных электронных каналов и 100 мкл свежих средних энтодермы грунт, дополняется 100 нг/мл Activin A и 50 нг/мл Wnt3a.Примечание: Процесс дифференциации начинается после окончательного энтодермы среднего добавлен. После заполнения ячейки оптимизирована, клеточной дифференциации обычно начинается в течение 24 ч. Все среднего изменения выполняются путем удаления средство с системой Дозатор автоматический ручных электронных каналов и дозирования 100 мкл свежей среды с использованием автоматической обработки жидких Диспенсер со стандартным трубки дозирования кассеты, если иное указанный. С 96 скважины, используя 300 мкл советы использовалась система Дозатор автоматический ручной электронный канал. Вкратце 90 мкл были придыханием от хорошо избегая любой контакт с клетками, и это важно высохнуть не клетки во время среднего изменения уменьшить стресс клеток. Для человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) измените энтодермы дифференциации среднего ежедневно в течение трех дней. Если дифференциация проводится для человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), продлить этап окончательного Эндодерма 2 дополнительных дней, только с помощью Activin A. После окончательного энтодермы индукции переключитесь носитель KSR/ДМСО для спецификации hepatoblast и изменить носитель каждые 2 дня на 5 дней.Примечание: Если существует ряд не придает клеток в колодец, используйте-дополнение ко-DMEM мыть клетки один раз до следующего изменения средних. Из-за продолжительности второго этапа протокола (5 дней) будет 3 среднего изменения с последнего в последний день hepatoblast спецификации. После hepatoblast дифференциации перейдите на HepatoZYME среднего созревания гепатоцитов. Вымыть клетки один раз с HepatoZYME без дополнения после удаления KSR/ДМСО среднего и 100 мкл HepatoZYME среднего созревания дополнена HGF 10 нг/мл и 20 нг/мл OSM. Изменение среднего каждые 48 ч для 7-10 дней. В день 18 дифференциации характеризуют кг путем анализа экспрессии генов и метаболическую активность CYP P450. 3. характеристика гепатоцито подобных клеток дифференцированы на рекомбинантной Laminins Определить выражение гепатоцито специфических маркеров и поляризации маркеры с помощью иммуноокрашивания. Испытания гепатоцитов метаболические функции с помощью анализов CYP P450 как описано до12. Определите вариации пластины, подсчет общего количества клеток на хорошо за тарелку. 4. Высокая пропускная способность иммуноцитохимии и захвата изображений В день 18 дифференциации Промыть лунки три раза с 1 x DPBS, исправить кг дозирующего 50 мкл параформальдегида 4% (PFA) и инкубации при комнатной температуре 15-30 мин. После фиксации, мыть три раза с PBST (0.1% анимации) (без Ca2 +/Mg2 +) с помощью автоматического пластины шайбу.Примечание: Все моет в этом разделе выполняются с использованием автоматического пластины шайбу, если не указано иное. Все моет сделали после тот же протокол. Разрушения мембраны путем выдачи 100 мкл PBST (без Ca2 +/Mg2 +) и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре. Далее выполните белка блокирование дозирования 100 мкл 10% BSA в PBST и инкубировать 1 час в мягкий встряхивания с помощью пластины шейкер. После блокирования белка 50 мкл 1% BSA в PBST, содержащие первичных антител, Инкубируйте на 4 ° C на ночь с нежным встряхивания с помощью пластины шейкер.Примечание: Не мойте между белка блока и антитела сложения. После 24 часов мыть три раза с 1 x DPBS (без Ca2 +/Mg2 +) и добавить вторичные антитела путем выдачи 50 мкл 1% BSA в PBST. Инкубируйте 1 час при комнатной температуре в темноте. После вторичное антитело инкубации мыть 3 раза с 1 x DPBS. Добавьте 50 мкл DPBS с DAPI (10 мкг/мл) и проинкубируйте 5 – 10 мин при комнатной температуре в темноте. Наконец мыть 3 раза с DPBS и оставить 100 мкл 1 x DPBS в скважине. Пластины готовы для обработки изображений.Примечание: Плиты должны храниться при температуре 4 ° C в темноте до изображений. Изображение пластину с помощью системы визуализации высоким содержанием и приобрести несколько полей через хорошо, чтобы получить хорошее представление о хорошо. Количественно выражение различных маркеров в кг, используя Колумба (программное высоким содержанием Imaging анализа системы).Примечание: Колумб является высокое содержание анализа программного обеспечения, которое предлагает анализ сегментации клеток для фенотипа клетки. Аналогичные результаты могут быть достигнуты с помощью CellProfiler, открытым исходным кодом для количественного анализа биологических изображения22.

Representative Results

Дифференцировки клеток была выполнена с использованием эмбриональных стволовых клеток линии (H9). Полуавтоматические платформа была использована для дифференцировать и характеризуют клетки (рис. 1A). Автоматическая обработка жидких распылитель был использован для пальто матрицы и семян одиночных клеток. Клеточной дифференциации была начата, когда клетки достигли 40% confluency (день 0). Средства массовой информации изменения были выполнены с помощью системы Дозатор автоматический ручных электронных каналов для удаления среднего и дозатор жидкого обработки для среднего сложения (рис. 1A). Клетки фиксации и окраски были проведены с использованием автоматической обработки жидких диспенсер в сочетании с автоматической пластины шайбу. Изображений и количественной оценки были выполнены с помощью высоким содержанием съемочной системы и программного Columbus. Активность цитохрома P450 была измерена с помощью установленных assay. После инкубации субстрата supernatants клетки были собраны, и биолюминесценции записаны с помощью многомодовых Гонав читателя (рис. 1A). Кроме того обычные Фазово-контрастная микроскопия был использован для измерения изменений в морфологии клеток во время дифференциация гепатоцитов (рис. 1B). День 18 изменчивость количества клеток между скважинами был рассмотрен после DAPI окрашивание (рис. 2A). Семь полей зрения были захвачены в колодец и количество ядер количественно (рис. 2A). Мы обнаружили не статистические различия между скважинами с в среднем 41,662 ±3, 366 ячеек на колодец (рис. 2B). В день 18 кг были исправлены и витражи для типичных гепатоцитов маркеры (рис. 3A-G) и испытания на активность CYP P450. Кг выразил гепатоцитов маркеры, такие как HNF4α (89,2% ±2 позитивные клетки), ALB (92,8% ±6 позитивные клетки), AFP (61,8% ±2 позитивные клетки). Кг также выразил CYP P450 белков, CYP2D6 и CYP3A4 и отображается собственный полигональных внешний вид, как показано выражением E-Кадгерины белка. В день 18 измеряли активность CYP P450 кг. Кг выставлены CYP1A2 активности на 295,906 ±45, 828 RLU/мл/мг белка и CYP3A в 1,066,112 ±177, 416 RLU/мл/мг белка (рис. 3 H). Рисунок 1: дифференциация гепатоцит от ЦОНов в 96 хорошо формате. (A). схема оборудования, используемого для полуавтомат клеточной дифференцировки, фиксация, окрашивание, обработки изображений и функциональной активности. (B). представитель изменения в клеточной морфологии во время HLC дифференциации. Вкратце PSC нацелены сторону окончательного энтодермы, следуют спецификации hepatoblast, характеризуется отображения булыжник как морфология клеток и до созревания гепатоцитов с клетками, приобретения многоугольной формы. Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2: Оценка изменчивости кг ну ну. (A) представление 96 хорошо пластины вид окрашенных с DAPI кг. Шкалы бар = 1 mm. (B) количественного определения количества клеток в колодец. Среднее количество клеток на скважин в столбцах (вверху) и строк (внизу), из семи областей просмотров в хорошо и количественных с помощью программного Columbus. Средний мобильный номер через пластину-41,662 ± 3,366 SEM ячеек на хорошо. Статистически значимой разницы не наблюдались между скважинами. Был нанят односторонним ANOVA с Тьюки в пост hoc статистических тестов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3: гепатоцитов маркер выражения и измерения активности CYP P450 в кг в день 18. (A) доля гепатоцит ядерного фактора 4 альфа (HNF4α) выражение ± SEM основывается на 30 скважин с десяти поля зрения за хорошо. (Б) процент альбумина (ALB) выражение + / SEM, основан на 3 отдельных скважин с десяти поля зрения за хорошо. (C) процент Альфа-фетопротеин (АФП) + / SEM основан на 3 отдельных скважин с десяти поля зрения за хорошо. (D) E-Кадгерины пятнать. (E) CYP2D6 пятнать. (F) CYP3A4 пятнать. (G). иммуноглобулин G (IgG) окрашивания элемента управления. Шкалы бар = 50 µm. P450 (H) CYP 1A2 и 3A метаболической активности в кг в день 18. Представляет данные, которые шесть биологического реплицирует + / SEM. деятельность цитируется как относительные единицы легких (RLUs) / мл в 1 мг белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Наши полуавтоматические процедура является эффективным, надежным и экономичным, позволяя производство кг в масштабе (рис. 1). Не было каких-либо существенное различие с точки зрения числа клеток между скважин в пластине, что делает эта платформа подходит подход на основе ячеек скрининга (рис. 2). Кроме того процесс полу автоматизации позволяет пользователю производить большое количество пластин сразу, что было невозможно перед использованием ручных процессов5,12.

Важно отметить, что процесс автоматизации не повлияло на урожайности дифференциации, с большинство клеток, выражая HNF4α (89,2% ±2) и ALB (92,8% ±6) (рис. 3). Кг также выразил ферменты CYP Р450 CYP2D6 и CYP3A4 и отображается CYP1A2 и CYP3A метаболической активности, сопоставимые с ранее сообщалось экспериментов (рис. 3)5. Несмотря на стандартизации протокола confluency клетки до дифференциация имеет решающее значение для чистого HLC дифференциации. Таким образом обеспечение распределения хорошие клетки через колодец является важным фактором (рис. 1). Это оказалась зависимой клеточной линии, поэтому оптимизация посева и плотность клеток требуется для каждой ячейки строки перед масштабирования.

В его нынешнем виде эта платформа подходит не производить большое количество кг для клинического применения, и это скорее всего будет достигаться за счет использования фабрики клетки и биореакторов. Однако разработанная методика позволяют для быстрого поколения клеток печени человека для моделирования заболевания, скрининга наркотиков и/или наркотиков, повторное использование исследований. Кроме того assay поддается мультиплексирование, разрешительные поколения многопараметрических наборов данных для механистический анализа. Продвигаясь вперед, мы также считаем, что эта технология может применяться для более сложных в vitro систем, таких как 3D дифференциации или платформу для улучшения HLC фенотип в пробирке.

В заключение мы считаем, что нашей простой и полуавтоматические системы будет увеличить экспериментальной пропускную способность и уменьшить экспериментальный вариант, тем самым улучшая качество биологических наборов данных и их экстраполяции к физиологии человека.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа было поддержано награды от главного ученого бюро (TCS/16/37) и MRC PhD стипендии.

Materials

405 LS Washer Biotek
B27 supplement Life Technologies 12587-010
beta-mercaptoethanol Life Technologies 31350
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2058
DMSO Sigma-Aldrich D5879
DPBS with Calcium and Magnesium ThermoFisher 14040133
Gentle cell dissociation reagent STEMCELL Technologies 7174
GlutaMax Life Technologies 35050
GripTips for VIAFLO 96 Integra 6434
HepatoZYME-SFM Life Technologies   17705021
Human Activin A Peprotech 120-14E
Human Hepatocyte Growth Factor Peprotech 100-39
Human Oncostatin M Peprotech 300-10
Human Recombinant Laminin 521 BioLamina LN521-02
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt Sigma-Aldrich H4881
Knockout DMEM Life Technologies 10829
Knockout Serum Replacement Life Technologies 10828
mTeSR1 medium STEMCELL Technologies 5850
MultidropCombi Reagent Dispenser ThermoFisher 5840300
Non-essential amino acids Life Technologies 11140
Operetta High-Content Imaging System PerkinElmer HH12000000
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Life Technologies 15140122
Recombinant mouse Wnt3a R&D Systems 1324-WN-500/CF
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 Sigma-Aldrich Y0503-1MG
RPMI 1640 Life Technologies 21875
Standard tube dispensing cassette ThermoFisher 24072670
TWEEN 20 Sigma-Aldrich P9416 
VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette Integra 6001
PBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190250
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 Sigma-Aldrich 1.00496 EMD MILLIPORE
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System Promega V8801
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System Promega V8771
DAPI Invitrogen D1306
Antibodies
Albumin Sigma-Aldrich A6684 1:200 (mouse)
Alpha-fetoprotein Abcam ab3980 1:500 (mouse)
CYP2D6 University of Dundee University of Dundee 1:200 (sheep)
CYP3A4 University of Dundee University of Dundee 1:200 (sheep)
HNF-4α Santa Cruz sc-8987 1:400 (rabbit)
E-cadherin Abcam ab76055 1:200 (mouse)
IgG DAKO 1:400
Anti-Mouse 488 (secondary antibody) Life technologies A-11001 1:400
Anti-sheep 488 (secondary antibody) Life technologies A-11015 1:400
Anti-rabbit 488 (secondary antibody) Life technologies A-11008 1:400
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory. J Hepatol. 62 (1, Supplement), S157-S169 (2015).
  2. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 170-182 (2016).
  3. Szkolnicka, D., Lucendo-Villarin, B., Moore, J. K., Simpson, K. J., Forbes, S. J., Hay, D. C. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Transl Med. 5 (6), 764-772 (2016).
  4. Choudhury, Y., et al. Patient-specific hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells model pazopanib-mediated hepatotoxicity. Sci Rep. 7, 41238 (2017).
  5. Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (6), 1250-1262 (2015).
  6. Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
  7. Takayama, K., et al. Prediction of interindividual differences in hepatic functions and drug sensitivity by using human iPS-derived hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16772-16777 (2014).
  8. Takayama, K., et al. 3D spheroid culture of hESC/hiPSC-derived hepatocyte-like cells for drug toxicity testing. Biomaterials. 34 (7), 1781-1789 (2013).
  9. Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells Dayt Ohio. 26 (4), 894-902 (2008).
  10. Iii, R. L. G., et al. Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture. PLOS ONE. 9 (1), e86372 (2014).
  11. Chen, Y. -. F., Tseng, C. -. Y., Wang, H. -. W., Kuo, H. -. C., Yang, V. W., Lee, O. K. Rapid generation of mature hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells by an efficient three-step protocol. Hepatol Baltim Md. 55 (4), 1193-1203 (2012).
  12. Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. JoVE J Vis Exp. (121), e55355 (2017).
  13. Takayama, K., et al. Long-Term Self-Renewal of Human ES/iPS-Derived Hepatoblast-like Cells on Human Laminin 111-Coated Dishes. Stem Cell Rep. 1 (4), 322-335 (2013).
  14. Kanninen, L. K., et al. Laminin-511 and laminin-521-based matrices for efficient hepatic specification of human pluripotent stem cells. Biomaterials. , 86-100 (2016).
  15. Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 141-148 (2014).
  16. Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387 (Supplement C), 1-9 (2017).
  17. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
  18. Grimm, F. A., Iwata, Y., Sirenko, O., Bittner, M., Rusyn, I. High-Content Assay Multiplexing for Toxicity Screening in Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes and Hepatocytes. Assay Drug Dev Technol. 13 (9), 529-546 (2015).
  19. Bray, M. -. A., et al. A dataset of images and morphological profiles of 30,000 small-molecule treatments using the Cell Painting assay. GigaScience. , (2017).
  20. Pradip, A., et al. High Content Analysis of Human Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes Reveals Drug Induced Steatosis and Phospholipidosis. Stem Cells Int. 2016, 2475631 (2016).
  21. Donato, M. T., Gómez-Lechón, M. J., Tolosa, L. Using high-content screening technology for studying drug-induced hepatotoxicity in preclinical studies. Expert Opin Drug Discov. 12 (2), 201-211 (2017).
  22. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).

Tags

Semi-automatedHepatocyte-like CellsPluripotent Stem CellsLaminin 521MTeSR1 MediumROCK Inhibitor Y27632Definitive Endoderm InductionKSR DMSO MediumHepatoblast SpecificationHepatoZYME Medium96-well FormatAutomated Liquid HandlingMass ProductionCell ConfluencyDifferentiation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (137), e57995, doi:10.3791/57995 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image