Production semi automatisée de Hepatocyte comme cellules de cellules souches pluripotentes

1. ensemencement des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) en 96 bien plaques d’hépatocytes différenciation Remarque : Les réactifs et les équipements utilisés dans le présent protocole a été énumérés au tableau 1. Support utilisé pour cette expérience doit être stérile et à température ambiante pour la culture cellulaire. Tous les volumes de réactifs/solution décrites dans cette partie du protocole sont basés sur un seul puits d’une plaque 96 puits, sauf indication contraire. Préparer laminine enduit les plaques bien 96. Décongeler un flacon de laminine recombinant 521 (100 µg/mL) (LN-521) pendant 2 h à une nuit à 4 ° C. Préparer une solution de 5 µg/mL en diluant LN-521 glacée 1 x tampon phosphate salin de Dulbecco (SPD) (avec Ca2 +/Mg2 +). Une manipulation distributeur avec un tube standard cassette de distribution de liquides automatique permet d’ajouter 50 µL de la solution de LN-521 / puits d’une plaque 96 puits.NOTE : Volume total de la dispense sont effectuées par un distributeur automatique manipulation de liquides avec un tube standard distribution cassette sauf indication contraire. Amorcer la solution jusqu’à ce qu’elle atteigne la fin de distribution de la cassette, puis continuez à distribuer. Plusieurs 96 plats peuvent être préparés dans la même expérience en répétant la procédure autant de fois que nécessaire. Incuber les plaques de revêtement LN521 à 37 °C/5% CO2 pendant 2 à 4 h.Remarque : LN521 revêtu de plaques peuvent être conservés jusqu’à deux semaines à 4 ° C. Garder les plaques scellées sur une surface plane afin d’éviter l’évaporation et la contamination. Le nombre requis de plaques revêtus à 37 ° C pendant 30 min à 1 h d’échauffement. Aspirer le reste de la solution de la surface à l’aide d’un adaptateur d’aspiration 8 canaux LN-521.Remarque : Il est essentiel d’éviter tout contact avec la surface recouverte pour éviter la dégradation du revêtement. Ajouter 50 µL / puits de mTeSR1 milieu supplémenté avec inhibiteur de kinase associée à Rho (ROCK) 10 µM Y27632 immédiatement et maintiennent la plaque dans l’incubateur cellule ensemencement à 37 °C/5% CO2.NOTE : Ne pas laisser les puits laminin-enduit sécher. Préparer une suspension de cellules de 3 x 105 cellules/mL dans mTeSR1 additionné à l’inhibiteur de ROCK 10 µM Y27632.Remarque : La densité de semis pour chaque lignée cellulaire nécessiteront d’optimisation. Aspirer le moyen d’une boîte de Pétri avec une culture non différenciée de hPSCs à environ 75 % à 85 % confluence cultivé sur LN-521 comme décrit plus haut12.Remarque : hPSCs sont cultivées sur LN-521 dans mTSER1 avec le milieu a changé toutes les 24 h et subcultures régulièrement une fois les cellules atteignent 80 % de confluence comme décrit précédemment12. Laver les cellules avec 5 mL de la température de la pièce 1 x DPBS (sans Ca2 +/Mg2 +) et aspirer la mémoire tampon. Ajouter 5 mL de 1 x doux réactif de Dissociation cellulaire aux cellules et incuber à 37 ° C pendant 6 à 8 min pour la dissociation cellulaire.Remarque : Pour arrêter la réaction, examinez le détachement des cellules de la matrice sous le microscope. Les cellules doivent être partiellement détachés de la plaque. Si ce n’est pas le cas, prolonger l’incubation pour un appoint 1 à 2 min. Fin de la réaction en aspirant le réactif de la Dissociation cellulaire doux et ajouter 5 mL de mTeSR1 frais additionné d’inhibiteur de ROCK 10 µM Y27632 aux cellules. Utilisez un grattoir de cellules pour soulever les cellules de la matrice et la pipette de haut en bas en utilisant un embout de P1000 plusieurs fois pour mélanger. Compter les cellules viables utilisant un hémocytomètre basé sur la méthode d’exclusion du bleu de Trypan et préparer la suspension cellulaire avec des concentrations requises. Pipeter le nombre désiré de cellules dans un tube à centrifuger 15 mL ou 50 mL stérile et faire tourner les cellules vers le bas en centrifugeant eux à 115 x g pendant 5 min à température ambiante.Remarque : Pour une 96 plaque bien, 5 mL de mTeSR1 milieu contenant 3 x 105 cellules/mL est requise pour la lignée de cellules H9. Aspirer le surnageant et doucement Resuspendre le culot cellulaire jusqu’à l’obtention d’une solution homogène à 37 ° C dans un mTeSR1 milieu supplémenté avec inhibiteur de ROCK 10 µM Y27632.Remarque : L’utilisation de l’inhibiteur de la roche est recommandée car il améliore la cellule survie post ré-ensemencement. Ajouter 50 µL de la suspension cellulaire sur la plaque bien 96 contenant 50 µL de mTeSR1 avec inhibiteur de ROCK 10 µM Y27632. Après l’ensemencement, regagner l’incubateur de cellules à 37 °C/5% CO2 pendant 24 heures afin de permettre les cellules fixer les plaques. Examiner les cellules le lendemain et retirer l’inhibiteur de la roche une fois établi le contact de cellule à cellule. À la confluence de 40 %, placez-vous au milieu de la différenciation (Figure 1 b).Remarque : Si la confluence de la cellule est supérieure à 40 %, les plaques ne conviennent pas pour la différenciation HLC avec la lignée cellulaire H9. 2. différenciation hPSCs de cellules semblables à des hépatocytes sur Recombinant laminines en plaques 96 puits Préparer la différenciation des facteurs de milieu et de la croissance. Préparer solution humaine activine A (100 µg/mL) en dissolvant la poudre activine A humaine dans stérile 0,2 % sérum d’albumine bovine (BSA) dans du PBS. Aliquote du stock et les conserver à-20 ° C. Utilisez à 1:1, 000. Préparer la souris Wnt3a (10 µg/mL) solution en dissolvant la poudre Wnt3a souris stérile 0,2 % BSA. Aliquote du stock et les conserver à-20 ° C. Utiliser au 1 : 200. Préparer d’hépatocytes humains facteur de croissance (HGF) (10 µg/mL) solution en dissolvant la poudre HGF humaine en stérile 0,2 % de BSA. Aliquote du stock et les conserver à-20 ° C. Utiliser au 1/1000. Préparer oncostatine M (OSM) (20 µg/mL) solution en dissolvant la poudre stérile 0,2 % BSA. Aliquote du stock et les conserver à-20 ° C. Utilisez à 1:1, 000. Endoderme définitif : préparer le moyen de différenciation endoderme, Supplément de 2 % B27 (50 x, sans insuline), consistant en 1 % pénicilline/streptomycine (concentration finale : 100 UI/mL et 100 µg/mL, respectivement) ajouté à Roswell Park Memorial Institute 1640 ( RPMI 1640) milieu de base. Conserver à 4 ° C et utiliser dans les deux semaines. A chaque changement moyen, compléter le volume requis avec activine A et Wnt3a à une concentration finale de 100 ng/mL et 50 ng/mL, respectivement. Hepatoblast différenciation : préparer le moyen de différenciation hepatoblast, consistant en remplacement de sérum de knockout de 20 % (KSR), 0,5 % une alternative supplément de L-glutamine, 1 % des acides aminés non essentiels (NEAA), 0,1 mM bêta-mercaptoéthanol, DMSO 1 % et 1 % la pénicilline/streptomycine (concentrations finales à 100 UI/mL et de 100 µg/mL, respectivement) ajouté à débouchure DMEM (KO-DMEM). Filtrer sous vide et conserver à 4 ° C. Utiliser dans les deux semaines. Différenciation des hépatocytes : préparer le milieu de différenciation hépatocyte, composé de 1 %, une solution de rechange supplément de L-glutamine, 10 µM hydrocortisone 21-sodium hémisuccinate (HCC), 1 % pénicilline/streptomycine (concentrations finales à 100 UI/mL et 100 µg/mL, respectivement) ajouté au milieu de HepatoZYME. Stocker le stock à 4 ° C et utiliser dans les deux semaines. Pour chaque changement médiatique, compléter le volume requis par HGF et OSM (concentration finale 10 ng/mL et 20 ng/mL, respectivement). après 24h, ensemencement, retirer le support à l’aide d’un système de pipette automatique de canaux électroniques portatifs soigneusement et ajouter 100 µL de milieu d’amorçage / endoderme frais additionné de 100 ng/mL activine A et 50 ng/mL Wnt3a.Remarque : Le processus de différenciation commence une fois que le milieu de l’endoderme définitif a été ajouté. Une fois que l’ensemencement de la cellule est optimisé, la différenciation cellulaire est normalement initiée sous 24h. Moyen toutes les modifications sont effectuées en enlevant le milieu avec un système de pipette automatique de canaux électroniques portatifs et distribuer 100 µL de milieu frais à l’aide d’un distributeur automatique manipulation de liquides avec une norme tube cassette distribution sauf si autrement spécifié. Un système de pipette automatique de canaux électroniques portatifs a été utilisé avec une tête de puits, utilisant 300 µL pointe de 96. En bref, 90 µL ont été aspiré de la bien en évitant tout contact avec les cellules, et il ne faut ne pas faire sécher les cellules pendant le changement moyen pour réduire le stress cellulaire. Pour les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh), changer le moyen de différenciation endoderme quotidiennement pendant trois jours. Si la différenciation s’effectue pour les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs), prolonger la phase de l’endoderme définitif pour 2 jours supplémentaires à l’aide d’activine A seulement. Après l’induction de l’endoderme définitive, passer au milieu de KSR/DMSO pour la spécification de hepatoblast et changer le milieu tous les 2 jours pendant 5 jours.Remarque : S’il y a un certain nombre de cellules non inscrits dans le puits, utiliser non supplémenté KO-DMEM pour laver les cellules une fois avant le prochain changement médiatique. En raison de la durée de la deuxième phase du protocole (5 jours), il y aura 3 modifications moyennes dont la dernière le dernier jour de la spécification hepatoblast. Suite à la différenciation hepatoblast, passer au milieu de HepatoZYME pour la maturation de l’hépatocyte. Laver les cellules une fois avec HepatoZYME sans le supplément après avoir enlevé le milieu KSR/DMSO et ajouter 100 µL de milieu de maturation HepatoZYME additionné de 10 ng/mL HGF et 20 ng/mL OSM. Changer le support de toutes les 48 h pour les 7 à 10 jours. Au 18e jour de la différenciation, caractériser HLCs en analysant l’expression génique et l’activité métabolique de CYP P450. 3. caractérisation des hépatocytes-comme des cellules différenciées sur laminines Recombinant Détecter l’expression des marqueurs spécifiques des hépatocytes et des marqueurs de polarisation à l’aide d’immunomarquage. Tester la fonction métabolique hépatocyte utilisant la CYP P450 comme décrit avant le12. Déterminer la variation de la plaque, comptant le nombre total de cellules par puits par plaque. 4. haut débit immunocytochimie et Acquisition d’images Jour 18 de différenciation, laver les puits trois fois avec 1 x DPBS, à résoudre les HLCs de distribution 50 µL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) et incuber à température ambiante pendant 15 à 30 min. Après fixation, laver trois fois avec PBST (0,1 % tween) (sans Ca2 +/Mg2 +) en utilisant une machine à laver automatique de plaques.Remarque : Tous les lavages dans cette section sont effectuées à l’aide d’un laveur de plaques automatique sauf indication contraire. Tous les lavages sont faits suivant le même protocole. Permeabilize la membrane de distribution à 100 µL de PBST (sans Ca2 +/Mg2 +) et incuber pendant 20 min à température ambiante. Ensuite, effectuer le blocage de protéine par dosage 100 µL de 10 % de BSA dans du PBST et incuber pendant 1 heure en agitant doucement à l’aide d’un agitateur de plaque. Après le blocage de la protéine, ajouter 50 µL de 1 % de BSA dans du PBST contenant les anticorps primaires, incuber à 4 ° C pendant la nuit avec agitant doucement à l’aide d’un agitateur de plaque.Remarque : Ne pas laver entre ajout bloc et anticorps de protéine. Après 24h, laver trois fois avec 1 x DPBS (sans Ca2 +/Mg2 +) et ajoutez l’anticorps secondaire de distribution 50 µL de 1 % de BSA dans du PBST. Incuber 1 h à température ambiante dans l’obscurité. Après l’incubation de l’anticorps secondaire, laver 3 fois avec 1 x DPBS. Ajouter 50 µL de SPD au DAPI (10 µg/mL) et incuber pendant 5 à 10 min à température ambiante dans l’obscurité. Enfin, laver 3 fois avec le SPD et laisser 100 µL de 1 x DPBS dans le puits. Les plaques sont prêtes pour l’imagerie.NOTE : Plaques doivent être conservés à 4 ° C dans l’obscurité jusqu’à l’imagerie. L’image de la plaque à l’aide d’un système d’imagerie de haute teneur et acquérir plusieurs champs dans le puits afin d’obtenir une bonne représentation du puits. Quantifier l’expression des marqueurs différents dans les HLCs en utilisant le logiciel de Columbus (logiciel système d’analyse d’imagerie haute teneur).NOTE : Columbus est un logiciel d’analyse de contenu élevé, qui offre l’analyse par segmentation cellulaire pour la détermination du phénotype cellulaire. Des résultats similaires peuvent être obtenus à l’aide de CellProfiler, un logiciel open-source pour l’analyse quantitative d’images biologiques22.