יצור אוטומטי למחצה של Hepatocyte כמו תאים מתאי גזע Pluripotent

1. זריעת תאי גזע Pluripotent (hPSCs) לתוך 96 טוב צלחות עבור Hepatocyte בידול אנושי הערה: ריאגנטים וציוד המשמשים פרוטוקול זה רשומה בטבלה1. מדיה המשמשת עבור ניסוי זה חייב להיות סטרילי, בטמפרטורת החדר במשך תרבית תאים. כל אמצעי האחסון ריאגנט/הפתרון המתואר בחלק זה של הפרוטוקול מבוססים על טוב יחיד של צלחת 96-ובכן, אלא אם צוין אחרת. להכין laminin מצופה לוחות טוב 96. הפשרת בקבוקון של recombinant laminin 521 (100 µg/mL) (LN-521) עבור 2 h ללון ב 4 º C. הכן µg 5/mL פתרון על ידי דילול LN-521 כקרח 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח של Dulbecco (DPBS) (עם Ca2 +/Mg2 +). השתמש של נוזל אוטומטי טיפול מתקן עם צינור סטנדרטי dispensing קלטת כדי להוסיף 50 µL של הפתרון LN-521 לכל טוב של צלחת טוב 96.הערה: כל אמצעי האחסון dispenses מבוצעות באמצעות מתקן טיפול בנוזלים אוטומטית עם צינור סטנדרטי dispensing קלטת אלא אם צוין אחרת. פריים הפתרון עד שהוא מגיע לסוף שחולק הקלטת, ולאחר מכן להמשיך לוותר. לוחות מרובים 96-ובכן ניתן להכין על אותו ניסוי על-ידי חזרה על התהליך כמה פעמים לפי הצורך. דגירה הלוחות מצופים LN521-37 °C/5% CO2 עבור 2-4 h.הערה: צלחות מצופה LN521 ניתן לאחסן שבועיים, 4 מעלות צלזיוס. שמור את הצלחות חתומות על משטח שטוח כדי למנוע אידוי וזיהום. חממו המספר הנדרש של צלחות מצופה מראש ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי 1 h. האחות הפתרון LN-521 הנותרים של המשטח מצופה באמצעות מתאם השאיפה ערוץ 8.הערה: חיוני כדי להימנע מכל מגע עם פני השטח מצופה כדי למנוע השפלה ציפוי. מיד להוסיף µL 50 לכל טוב של בינוני mTeSR1 בתוספת 10 מיקרומטר קינאז הקשורים רו (רוק) מעכב Y27632 ולהשאיר את הצלחת בחממה עד תא זריעה-37 °C/5% CO2.הערה: אל תאפשר את הבארות מצופים laminin להתייבש. להכין השעיה תא של 3 x 105 תאים למ”ל בינוני mTeSR1 בתוספת 10 מיקרומטר רוק מעכבי Y27632.הערה: צפיפות זריעה עבור כל קו תא ידרוש אופטימיזציה. האחות המדיום של צלחת פטרי עם תרבות מובחן של hPSCs כ 75%-85% confluency תרבותי-LN-521 תיאר כאמור12.הערה: hPSCs מתורבתים ב- LN-521 ב mTSER1 עם המדיום השתנה כל 24 שעות, passaged באופן סדיר פעם התאים להגיע 80% confluency כמו שתואר לעיל12. לשטוף את התאים עם 5 מ של טמפרטורת החדר 1 x DPBS (ללא Ca2 +/Mg2 +), לשאוב המאגר. הוסף 5 מ של 1 x ריאגנט עדין של דיסוציאציה התא לתאים, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 6 עד 8 דקות עבור תא דיסוציאציה.הערה: כדי לעצור את התגובה, לבחון בניתוק של תאים מן המטריצה מתחת למיקרוסקופ. התאים צריך להיות מנותקת חלקית מהצלחת. אם לא, להרחיב את הדגירה למשך דקות תוספת 1 עד 2. לסיים את התגובה על ידי כ רפה בעברית הכימית דיסוציאציה תא עדין ולהוסיף 5 מיליליטר בינוני mTeSR1 טרי בתוספת 10 מעכב רוק מיקרומטר Y27632 לתאים. להשתמש במגרדת תא להרים את התאים מטריקס, פיפטה למעלה ולמטה באמצעות טיפ P1000 מספר פעמים כדי לערבב. לספור את התאים קיימא באמצעות hemocytometer בהתבסס על Trypan Blue מכתים אי-הכללה של שיטת והכן התליה תא עם ריכוזים הנדרש. Pipette מספר התאים הרצוי לתוך שפופרת צנטרפוגה סטרילי, 15 מ”ל או 50 מ ל, ספין התאים למטה על-ידי צריך שתוציאו אותם ב x 115 g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.הערה: עבור 96 אחד טוב צלחת, 5 מ של mTeSR1 בינוני המכיל 3 x 105 תאים למ”ל נדרש עבור שורת תאים H9. וארוקן את תגובת שיקוע, בעדינות resuspend בגדר תא עד מתקבל פתרון הומוגני ב 37 מעלות צלזיוס בינוני mTeSR1 בתוספת 10 מיקרומטר רוק מעכבי Y27632.הערה: השימוש של רוק מעכב מומלצת שכן היא משפרת את התא הישרדות פוסט מחדש ציפוי. הוסף µL 50 של התליה תא לצלחת טוב 96 המכיל 50 µL של mTeSR1 עם 10 מיקרומטר רוק מעכבי Y27632. לאחר זריעה, להחזיר את הצלחות החממה תא-37 °C/5% CO2 במשך 24 שעות ביממה לאפשר את התאים לצרף. לבחון את התאים למחרת ולסגת מעכב רוק לאחר הקימה הקשר מתא לתא. ב- 40% confluency, לעבור התמיינות בינוני (איור 1B).הערה: אם תא confluency גבוהה מ- 40%, הלוחות אינם מתאימים עבור בידול סוללות היבריד עם הקו תא H9. 2. להבדיל hPSCs לתאי Hepatocyte דמוי רקומביננטי Laminins ב 96 טוב צלחות הכינו הבידול גורמים בינוני וצמיחה. להכין Activin A אנושי מניות פתרון (100 µg/mL) על ידי המסת אבקת Activin A אנושי סטרילי 0.2% שור אלבומין (BSA) ב- PBS. Aliquot המניה וחנות ב-20 ° C. השתמש ב- 1:1, 000. להכין את העכבר Wnt3a מניות פתרון (10 µg/mL) על ידי המסת אבקה Wnt3a העכבר ב- BSA 0.2% סטרילי. Aliquot המניה וחנות ב-20 ° C. השתמש ב- 1:200. להכין hepatocyte האנושי גורם הגדילה (דבורה שחר) מניות פתרון (10 µg/mL) על ידי המסת אבקה דבורה שחר האנושי ב- BSA 0.2% סטרילי. Aliquot המניה וחנות ב-20 ° C. השתמש ב- 1:1000. להכין Oncostatin M (OSM) מניות פתרון (20 µg/mL) על ידי המסת האבקה ב- BSA 0.2% סטרילי. Aliquot המניה וחנות ב-20 ° C. השתמש ב- 1:1, 000. האנדודרם סופית: להכין האנדודרם בידול בינוני, בהיקף של 2% B27 תוספת (x 50, ללא אינסולין), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (ריכוזים הסופי: 100 IU/mL ו- 100 µg/mL, בהתאמה) נוספו רוזוול פארק אנדרטת המכון 1640 ( RPMI 1640) בינוני הבזליים. לאחסן ב 4 ° C ולהשתמש תוך שבועיים. בכל שינוי בינוני, תוספת האחסון הנדרש עם Activin ו Wnt3a-הריכוז הסופי של 100 ננוגרם למ”ל ו 50 ng/mL, בהתאמה. בידול Hepatoblast: להכין hepatoblast בידול בינוני, בהיקף של 20% נוקאאוט סרום חלופי (אופנוע), 0.5% חלופה תוספת לגלוטמין, חומצות אמינו שאינן הכרחיות 1% (NEAA), מ מ 0.1 בטא-mercaptoethanol, דימתיל סולפוקסיד 1% ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין (ריכוזים הסופי ב 100 IU/mL ו- 100 µg/mL, בהתאמה) נוספו נוקאאוט DMEM (KO-DMEM). לסנן תחת ואקום ולאחסן ב 4 º C. השתמש בתוך שבועיים. בידול hepatocyte: להכין hepatocyte בידול בינוני, בהיקף של 1% חלופה תוספת לגלוטמין, 10 מיקרומטר הידרוקורטיזון 21-hemisuccinate נתרן מלח (HCC), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (ריכוזים הסופי ב 100 IU/mL, µg 100/mL, בהתאמה) נוספו HepatoZYME בינונית. לאחסן את המניה ב 4 ° C ולהשתמש תוך שבועיים. עבור כל שינוי בינוני, שמשלימה את אמצעי האחסון הדרושים עם דבורה שחר, OSM (ריכוזים הסופי ב 10 ng/mL ו 20 ng/mL, בהתאמה). פוסט 24 שעות זריעה, בזהירות להסיר את המדיום באמצעות מערכת אוטומטית ערוץ אלקטרוניים ידניים פיפטה ולהוסיף µL 100 של מדיום האנדודרם-לקרקע טרי בתוספת 100 ננוגרם למ”ל Activin A ו- 50 ננוגרם למ”ל Wnt3a.הערה: תהליך התמיינות מתחילה ברגע המדיום האנדודרם סופית נוספה. לאחר זריעה התא הוא אופטימלי התמיינות מאותחלת בדרך כלל בתוך 24 שעות. בינוני כל השינויים מתבצעים על ידי הסרת המדיום עם מערכת פיפטה אוטומטי ערוץ אלקטרוניים ידניים, מחלק µL 100 בינוני טריים באמצעות מתקן טיפול בנוזלים אוטומטית עם תקן צינור קלטת שחולק אלא אם אחרת שצוין. מערכת אוטומטית ערוץ אלקטרוניים ידניים פיפטה שימש עם 96 ראש טוב, באמצעות טיפים µL 300. בקצרה, 90 µL היו aspirated מ טוב הימנעות מכל מגע עם תאי, חשוב לא לייבש את התאים במהלך שינוי בינונית להפחתת מתח התא. תאי גזע עובריים (hESCs), החליפו המדיום בידול האנדודרם מדי יום למשך שלושה ימים. אם הבידול מבוצע עבור האדם המושרה גזע pluripotent (hiPSCs), להרחיב את הבמה האנדודרם מוחלטת במשך יומיים נוספים באמצעות רק Activin. לאחר אינדוקציה האנדודרם סופית, להחליף אופנוע/דימתיל סולפוקסיד לבינוני עבור מפרט hepatoblast ולאחר שנה המדיום כל יומיים במשך 5 ימים.הערה: אם ישנם מספר של תאים שאינם מצורפים בבאר, השתמש שאינם בתוספת קו-DMEM לרחוץ את התאים פעם אחת לפני השינוי בינוני הבא. בשל משך הזמן של השלב השני של הפרוטוקול (5 ימים), יהיו שינויים בינוני 3 עם האחרון ביום האחרון של מפרט hepatoblast. בעקבות הבידול hepatoblast, לעבור HepatoZYME בינונית עבור hepatocyte ההבשלה. לשטוף את התאים פעם אחת עם HepatoZYME ללא תוספת לאחר הסרת אופנוע/דימתיל סולפוקסיד בינונית, להוסיף 100 µL של HepatoZYME בינוניים בתוספת 10 ננוגרם למ”ל דבורה שחר ו 20 ng/mL OSM. לשנות את המדיום כל 48 שעות 7 עד 10 ימים. -יום 18 של הבידול, לאפיין HLCs על-ידי ניתוח CYP P450 פעילות חילוף החומרים של ביטוי גנים. 3. אפיון Hepatocyte כמו תאים הבדיל על רקומביננטי Laminins לאתר את הביטוי של סמנים hepatocyte ספציפיים וסמנים קיטוב באמצעות immunostaining. מבחן hepatocyte פונקציה מטבולית באמצעות מבחני CYP P450 כמתואר לפני12. לקבוע את הווריאציה צלחת, לספור את המספר הכולל של תאים לכל טוב לכל צלחת. 4. תפוקה גבוהה Immunocytochemistry ורכישת תמונות ביום 18 של בידול, לשטוף את הבארות שלוש פעמים עם 1 x DPBS, לתקן את HLCs על-ידי שחולק 50 µL של 4% paraformaldehyde (PFA), דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 30 דקות. לאחר הקיבעון, לשטוף שלוש פעמים עם PBST (0.1% tween) (ללא Ca2 +/Mg2 +) באמצעות דסקית צלחת אוטומטית.הערה: כל שוטף בסעיף זה מבוצעות באמצעות דסקית צלחת אוטומטי אלא אם צוין אחרת. כל שוטף נעשים בעקבות באותו הפרוטוקול. Permeabilize את הקרום על ידי שחולק µL 100 של PBST (ללא Ca2 +/Mg2 +), תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לבצע חסימת חלבון מאת שחולק 100 µL של BSA 10% ב- PBST, תקופת דגירה של h 1 לוחצים בעדינות בעזרת מטרף צלחת. לאחר חסימת חלבון, להוסיף 50 µL של 1% BSA PBST המכיל את הנוגדנים העיקרי, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם טלטול עדין בעזרת מטרף צלחת.הערה: אנחנו לא שוטפים בין תוספת חלבון בלוק של נוגדן. לאחר 24 שעות, לשטוף שלוש פעמים עם x DPBS 1 (ללא Ca2 +/Mg2 +) ולהוסיף הנוגדן משני על ידי שחולק 50 µL של BSA 1% ב- PBST. דגירה h 1 בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר הדגירה נוגדנים משניים, לשטוף 3 פעמים עם 1 x DPBS. להוסיף 50 µL של DPBS עם דאפי (10 µg/mL) דגירה למשך 5 – 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לבסוף, לשטוף 3 פעמים עם DPBS ולהשאיר µL 100 של 1 x DPBS בבאר. לוחות מוכנים עבור הדמיה.הערה: צלחות לאחסנו ב 4 ° C בחושך עד הדמיה. תמונה את הצלחת באמצעות מערכת הדמיה גבוהה-תוכן, לרכוש מספר שדות על פני הבאר כדי לקבל ייצוג טוב של הבאר. לכמת את הביטוי סמנים שונים ב- HLCs באמצעות תוכנה קולומבוס (High-תוכן הדמיה ניתוח מערכת תוכנה).הערה: קולומבוס היא תוכנת ניתוח תוכן גבוהה, אשר מציע תא פילוח ןועברל תא phenotyping. תוצאות דומות יכולה להיות מושגת על ידי שימוש CellProfiler, תוכנה קוד פתוח עבור ניתוח כמותי של תמונות ביולוגי22.