Semi-automatische productie van Hepatocyte als cellen uit pluripotente stamcellen

1. het zaaien van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) in 96 goed platen voor Hepatocyte differentiatie Opmerking: Reagentia en apparatuur die wordt gebruikt in dit protocol is opgenomen in tabel 1. Voor dit experiment gebruikte media moet steriel en bij kamertemperatuur voor celkweek. Alle volumes van de reagens/oplossing beschreven in dit deel van het protocol zijn gebaseerd op een enkel putje van een 96-wells-plaat, tenzij anders aangegeven. Voorbereiden laminin gecoat 96 goed platen. Ontdooi een flesje van recombinante laminin 521 (100 µg/mL) (LN-521) voor 2 h naar girale bij 4 ° C. Bereid een 5 µg/mL oplossing door LN-521 verdunnen in ijskoude 1 x Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) (met Ca2 +/Mg2 +). Gebruik een automatische vloeistof dispenser verwerken met een standaard buis toedieningseenheden cassette te voegen 50 µL van de LN-521 oplossing per putje van een 96 goed plaat.Opmerking: Alle volume opleidingscyclus worden uitgevoerd met een automatische liquid handling dispenser met een standaard buis cassette verstrekking, tenzij anders aangegeven. Prime de oplossing tot het einde van de cassette verstrekking is bereikt, dan gaat u verder met het afzien. Meerdere 96 goed platen kunnen bereid worden in hetzelfde experiment door de procedure zo vaak als nodig te herhalen. Incubeer de platen van LN521-coating op 37 °C/5% CO2 gedurende 2 tot 4 uur.Opmerking: LN521 beklede platen kunnen worden opgeslagen tot twee weken bij 4 ° C. Houd de platen verzegeld op een vlakke ondergrond om verdamping en besmetting te voorkomen. Het vereiste aantal vooraf gecoate platen bij 37 ° C gedurende 30 minuten tot 1 uur opwarmen. De resterende LN-521 oplossing van het gecoate oppervlak met behulp van een 8-kanaals aspiratie adapter gecombineerd.Opmerking: Het is essentieel om te voorkomen dat elk contact met het gecoate oppervlak om te voorkomen dat de aantasting van de coating. Onmiddellijk Voeg 50 µL per putje van mTeSR1 medium aangevuld met 10 µM Rho-geassocieerde kinase (ROCK) remmer Y27632 en houden van de plaat in de incubator tot cel zaaien op 37 °C/5% CO2.Opmerking: De laminin-gecoate putten te drogen niet toegestaan. Bereid een celsuspensie van 3 x 105 cellen/mL in mTeSR1 medium aangevuld met 10 µM ROCK remmer Y27632.Opmerking: De seeding dichtheid voor elke cel regel zal optimalisatie nodig. Gecombineerd het medium van een petrischaal met een ongedifferentieerde cultuur van hPSCs op ongeveer 75% tot 85% confluentie gekweekt op LN-521 zoals eerder beschreven12.Opmerking: hPSCs worden gekweekt op LN-521 in mTSER1 met het medium veranderd elke 24 uur per dag, en regelmatig zodra de cellen bij 80% van confluentie als eerder beschreven12gepasseerd. Wassen van de cellen met 5 mL kamertemperatuur 1 x DPBS (zonder Ca2 +/Mg2 +) en aspirate de buffer. Voeg 5 mL 1 x zacht cel dissociatie reagens aan de cellen en Incubeer bij 37 ° C gedurende 6 tot 8 minuten voor cel dissociatie.Opmerking: Om te stoppen met de reactie, onderzoeken het detachement van de cellen van de matrix onder de Microscoop. De cellen moeten worden gedeeltelijk los van de plaat. Als dat niet het geval is, breiden de incubatie gedurende een extra 1 tot 2 minuten. Beëindigen van de reactie door de zachte cel dissociatie reagens aspirating en voeg 5 mL van verse mTeSR1 medium aangevuld met 10 µM ROCK remmer Y27632 aan de cellen. Gebruik een cel schraper tot opheffing van de cellen uit de matrix en de pipet op en neer met behulp van een P1000 tip meerdere malen te mengen. Tellen de levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer gebaseerd op Trypan blauw kleuring uitsluiting methode en voorbereiden van de celsuspensie met vereiste concentraties. Pipetteer van het gewenste aantal van de cellen in een steriele 15 mL of 50 mL centrifugebuis en draaien de cellen naar beneden door centrifugeren hen bij 115 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.Opmerking: Voor een 96 goed plaat, 5 mL van mTeSR1 medium met 3 x 105 cellen/mL is vereist voor de cellijn H9. De bovendrijvende substantie gecombineerd en zachtjes resuspendeer de pellet cel totdat een homogene oplossing wordt verkregen bij 37 ° C in mTeSR1 medium aangevuld met 10 µM ROCK remmer Y27632.Opmerking: Het gebruik van ROCK-remmer wordt aanbevolen als het verbetert cel overleving post opnieuw plating. Voeg 50 µL van de celsuspensie op de 96 goed bord met 50 µL van mTeSR1 met 10 µM ROCK remmer Y27632. Na het zaaien, terugkeren u de platen naar de cel incubator op 37 °C/5% CO2 gedurende 24 uur om de cellen te koppelen. Onderzoekt de cellen de volgende dag en ROCK-remmer te trekken zodra de contactpersoon van cel naar cel is vastgesteld. Bij 40% confluentie, overschakelen naar differentiatie medium (figuur 1B).Opmerking: Als cel confluentie hoger is dan 40%, de platen zijn niet geschikt voor HLC differentiatie met de cellijn H9. 2. differentiëren hPSCs naar Hepatocyte-achtige cellen in Recombinant Laminins in 96 goed platen Bereiden de differentiatie medium en groei factoren. Menselijke Activin A-stockoplossing (100 µg/mL) voor te bereiden door het oplossen van menselijke Activin A poeder in steriele 0,2% bovien serumalbumine (BSA) in PBS. Aliquot de voorraad en de winkel bij-20 ° C. Gebruik op 1:1, 000. Muis Wnt3a stockoplossing (10 µg/mL) voor te bereiden door het oplossen van de muis Wnt3a poeder in steriele 0,2% BSA. Aliquot de voorraad en de winkel bij-20 ° C. Gebruik op 1:200. Menselijke hepatocyte groeifactor (HGF) stockoplossing (10 µg/mL) voor te bereiden door het oplossen van menselijke HGF poeder in steriele 0,2% BSA. Aliquot de voorraad en de winkel bij-20 ° C. Gebruik op 1:1000. Oncostatin M (OSM) stockoplossing (20 µg/mL) voor te bereiden door het oplossen van het poeder in steriele 0,2% BSA. Aliquot de voorraad en de winkel bij-20 ° C. Gebruik op 1:1, 000. Definitieve endoderm: bereiden endoderm differentiatie medium, bestaande uit 2% B27 supplement (50 x, zonder insuline), 1% penicilline/streptomycine (eindconcentraties: 100 IU/mL en 100 µg/mL, respectievelijk) toegevoegd aan het Roswell Park Memorial Instituut 1640 () RPMI 1640) Basaal medium. Bewaren bij 4 ° C en binnen twee weken gebruiken. Bij iedere middelgrote wijziging, aanvulling op het vereiste volume met Activin A en Wnt3a op de eindconcentratie van 100 ng/mL en 50 ng/mL, respectievelijk. Hepatoblast differentiatie: bereiden van hepatoblast differentiatie medium, bestaande uit 20% knockout serum vervanging (KSR), 0,5% alternatief aanvulling op L-glutamine, 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA), 0.1 mM bèta-mercaptoethanol, 1% DMSO en 1% penicilline/streptomycine (eindconcentraties op 100 IU/mL en 100 µg/mL, respectievelijk) toegevoegd aan de knock-out DMEM (KO-DMEM). Filtreer onder drukvermindering door en bewaren bij 4 ° C. Binnen twee weken gebruiken. Hepatocyte differentiatie: voorbereiden van de hepatocyte differentiatie medium, bestaande uit 1% alternatief aanvulling op L-glutamine, 10 µM hydrocortison 21-hemisuccinate natriumzout (HCC), 1% penicilline/streptomycine (eindconcentraties bij 100 IU/mL en 100 µg/mL, respectievelijk) aan HepatoZYME medium toegevoegd. Slaan de voorraad bij 4 ° C en binnen twee weken gebruiken. Voor elke middelgrote wijziging, aanvulling op het vereiste volume met HGF en OSM (eindconcentraties op 10 ng/mL en 20 ng/mL, respectievelijk). 24 h post zaaien, zorgvuldig verwijderen van het medium met behulp van een automatische hand-held elektronisch kanaal Pipetteer systeem en voeg 100 µL van verse endoderm-priming medium aangevuld met 100 ng/mL Activin A en 50 ng/mL Wnt3a.Opmerking: De differentiatie proces begint zodra het definitieve endoderm medium is toegevoegd. Zodra de cel zaaien is geoptimaliseerd, wordt normaal gesproken de celdifferentiatie gestart binnen de 24u. Alle medium wijzigingen zijn uitgevoerd door het verwijderen van het medium met een systeem van automatische hand-held elektronisch kanaal pipet en verstrekking van 100 µL van verse medium met behulp van een automatische liquid handling dispenser met een standaard tube verstrekking cassette, tenzij anders opgegeven. Een automatische hand-held elektronisch kanaal Pipetteer systeem werd gebruikt met een goed hoofd, met behulp van 300 µL tips 96. In het kort, 90 µL waren aanzuiging van de goed het vermijden van alle contact met de cellen, en het is belangrijk om de cellen niet te droog tijdens middellange verandering cel stress te verminderen. Voor menselijke embryonale stamcellen (hESCs), wijzigt u het endoderm differentiatie medium dagelijks voor drie dagen. Als de differentiatie wordt uitgevoerd voor menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), verlengen de definitieve endoderm fase 2 extra dagen met behulp van Activin A alleen. Overschakelen naar KSR/DMSO medium voor hepatoblast specificatie na definitieve endoderm inductie, en wijzig het medium om de 2 dagen voor 5 dagen.Opmerking: Als er een aantal niet-ingeschrevenen cellen in de put, gebruiken niet-aangevuld KO-DMEM te wassen de cellen eenmaal vóór de volgende middellange verandering. Als gevolg van de duur van de tweede fase van het protocol (5 dagen), zullen er 3 middelgrote veranderingen met de laatste op de laatste dag van de hepatoblast-specificatie. Na de hepatoblast differentiatie, overschakelen naar HepatoZYME medium voor hepatocyte rijping. Spoel de cellen een keer met HepatoZYME zonder het supplement na het verwijderen van KSR/DMSO middellange en voeg 100 µL van HepatoZYME rijping medium aangevuld met 10 ng/mL HGF en 20 ng/mL OSM. Wijzig het medium elke 48u voor 7 tot 10 dagen. Op dag 18 van de differentiatie, HLCs wordt gekenmerkt door het analyseren van de genexpressie en CYP P450 metabole activiteit. 3. karakterisering van de Hepatocyte-achtige cellen gedifferentieerd op Recombinant Laminins De uitdrukking van de hepatocyte-specifieke markers en polarisatie markeringen met behulp van immunokleuring detecteren. Test hepatocyte metabole functie met behulp van CYP P450 assays zoals beschreven voor12. Het bepalen van de variatie van de plaat, tellen het totale aantal cellen per putje per plaat. 4. hoge-doorvoer immunocytochemie en beeldacquisitie Op dag 18 van differentiatie, was de putjes drie keer met 1 x DPBS, los van de HLCs door verstrekking 50 µL van 4% paraformaldehyde (PFA) en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 tot 30 minuten. Na de fixatie, wassen drie keer met PBST (0,1% tween) (zonder Ca2 +/Mg2 +) met behulp van een automatische plaat wasmachine.Opmerking: Alle wasbeurten in deze sectie worden uitgevoerd met behulp van een automatische plaat wasmachine, tenzij anders aangegeven. Alle wast zijn gedaan naar aanleiding van hetzelfde protocol. Permeabilize van het membraan door verstrekking 100 µL PBST (zonder Ca2 +/Mg2 +) en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens uitvoeren eiwit worden geblokkeerd door verstrekking 100 µL van 10% BSA in PBST en incubeer gedurende 1 h in zacht schudden met behulp van een shaker plaat. Na het eiwit blokkeren, voeg 50 µL van 1% BSA in PBST met de primaire antilichamen, bij 4 ° C na een nacht bebroeden met zacht schudden met behulp van een shaker plaat.Opmerking: Niet wassen tussen blok en antilichaam toevoeging van eiwit. Na 24u, Spoel driemaal met 1 x DPBS (zonder Ca2 +/Mg2 +) en voeg het secundaire antilichaam door verstrekking 50 µL van 1% BSA in PBST. Incubeer 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. Na de incubatie van secundair antilichaam, 3 keer te wassen met 1 x DPBS. Voeg 50 µL van DPBS met de DAPI (10 µg/mL) en incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Ten slotte, 3 keer wassen met DPBS en laat 100 µL van 1 x DPBS in de put. Platen zijn klaar voor de beeldvorming.Opmerking: Platen moeten worden bewaard bij 4 ° C in het donker tot imaging. Beeld van de plaat met behulp van een high-inhoud imaging systeem, en het verwerven van meerdere velden in de put te verkrijgen van een goede vertegenwoordiging van de put. Kwantificeren van de expressie van de verschillende markers in de HLCs door Columbus software (High-Content Imaging systeem analysesoftware) te gebruiken.Opmerking: Columbus is een hoge inhoudsanalyse software, die de analyse van de segmentatie van de cel voor cel fenotypering biedt. Vergelijkbare resultaten kunnen worden bereikt met behulp van CellProfiler, een open-source software voor kwantitatieve analyse van biologische beelden22.