多能性幹細胞からの細胞のような肝細胞の半自動化生産

1. ひと多能性幹細胞 (hPSCs) に 96 もプレートの肝細胞分化の播種 注: 試薬、このプロトコルで使用する機器は、表 1に記載されています。この実験で使用されるメディアは、生殖不能および細胞培養のため室温でにある必要があります。特に指定しない限り、プロトコルのこの部分に記載されているすべての試薬/ソリューション ボリュームは 96 ウェル プレートの単一の井戸に基づいています。 準備ラミニン コート 96 ウェル プレート。 組換えラミニン 521 (100 μ g/mL) のバイアルを解凍 (LN 521) 一夜に 4 ° C で 2 時間 5 μ g/mL の溶液を準備するには、冷たい 1 ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) (Ca2 +/Mg で2 +) x LN 521 を希釈します。 調剤カセット標準チューブでディスペンサーを扱う自動液体を使用すると、50 μ L/ウェルの 96 ウェル プレート LN 521 ソリューションを追加できます。注: すべてのボリューム分配が特に指定しない限り、カセットを調剤標準管自動液体ハンドリング ディスペンサーと実行されます。プライム ソリューション、カセットの調剤の終わりに到達するまでは、調剤に進みます。複数の 96 ウェル プレートは、回数に応じて手順を繰り返して、同じ実験で用意できます。 37 °C/5% CO2 2 に 4 h で LN521 コーティング版を孵化させなさい。注: LN521 コーティング プレートに格納できる 4 ° C で 2 週間蒸発し、汚染を避けるために平らな面にシール プレートを維持します。 1 時間に 30 分の 37 ° C でプレコート板の必要な数を暖かい。 8 ch 吸引アダプターを使用して塗装面の残りの LN 521 溶液を吸引します。注: コーティングの劣化を避けるために表面との接触を避けるために重要です。 すぐに 10 μ M (ロック) Rho 関連キナーゼ阻害剤 Y27632 mTeSR1 培のウェルあたり 50 μ L を追加し、細胞 37 °C/5% CO2播種までインキュベーターでプレートを保ちます。注: は、乾燥するラミニン コート井戸は認めません。 3 x 105セル/10 μ M ROCK 阻害剤 Y27632 mTeSR1 培 mL の細胞懸濁液を準備します。注: 各セルライン播種密度の最適化が必要になります。 培地を吸引 hPSCs で約 75% から 85% の未分化文化シャーレから LN 521 で培養の confluency 前述12。注: hPSCs が上で培養した LN 521 mTSER1 のすべての 24 h を変更し、セル前述12として密度の 80% に到達後、定期的に継代培地で。 洗浄室内温度 1 の 5 mL のセル (せずに Ca2 +/Mg2 +) x DPBS と吸引バッファー。 セルに優しく細胞解離試薬 × 1 の 5 mL を追加し、, 細胞解離の 6 ~ 8 分くらいの 37 ° C で。注: 反作用を停止し、するには、顕微鏡下でマトリックスから細胞の剥離を調べます。セルは、プレートから部分的に切断する必要があります。ない場合は、余分な 1 を 2 分間インキュベーションを拡張します。 穏やかな細胞解離試薬の吸引によって、反応を終了し、10 μ M ROCK 阻害剤 Y27632 細胞に新鮮な mTeSR1 培の 5 mL を追加します。細胞スクレーパーを使用して、マトリックスとピペットをミックスする数回 P1000 ヒントを使用して上下から細胞を持ち上げます。 トリパン ブルー染色除外法に基づく検定を使用して実行可能なセルをカウントし、必要な濃度と細胞懸濁液を準備します。 滅菌 15 mL や 50 mL の遠心管に必要な細胞数をピペット又それらを室温で 5 分間 115 x gで遠心分離によって細胞をスピンダウンします。注: 1 つの 96 ウェル プレート、mTeSR1 培 3 × 105セル/mL の 5 mL は H9 セル行必要です。 上清を吸引し、10 μ M ROCK 阻害剤 Y27632 mTeSR1 培の 37 ° C で同種のソリューションが得られるまで優しく細胞ペレットを再懸濁します。注: セル生存ポスト再めっきを改善しながら、ROCK 阻害剤の使用はお勧めします。 10 μ M ROCK 阻害剤 Y27632 と mTeSR1 の 50 μ L を含む 96 well プレートに細胞懸濁液の 50 μ L を追加します。 播種後、プレートを 37 °C/5% CO2を付けるセルを許可するように 24 時間で細胞インキュベータに戻ります。 次の日細胞を調べるし、細胞に細胞の接触が確立されたら、ROCK 阻害剤を撤回します。40% の confluency で分化培地 (図 1 b) に切り替えます。注: セル密度が 40% 以上の場合、プレートは、H9 セルラインで足 HLC の差別化のため適していません。 2. 96 プレートで組換え Laminins の肝細胞様細胞に hPSCs を区別します。 中小企業の成長要因の分化を準備します。 滅菌 0.2% ウシ血清アルブミン (BSA) の PBS で人間のアクチビン A 粉末を溶解することにより、人間のアクチビン A 原液 (100 μ g/mL) を準備します。在庫の約数と-20 ° C にてストア1:1, 000 で使用します。 0.2 %bsa を無菌のマウス Wnt3a 粉末を溶解することによりマウス Wnt3a 原液 (10 μ G/ml) を準備します。在庫の約数と-20 ° C にてストア1: 200 で使用します。 滅菌 0.2 %bsa で人間 HGF の粉末を溶解することにより、ひと肝細胞増殖因子 (HGF) 原液 (10 μ G/ml) を準備します。在庫の約数と-20 ° C にてストア1: 1000 で使用します。 オンコスタチン M (OSM) 原液 (20 μ g/mL) を準備するには、滅菌の 0.2 %bsa の粉末を溶解します。在庫の約数と-20 ° C にてストア1:1, 000 で使用します。 決定的な内胚葉: 2 7 サプリメント (50 x、インスリンがなければ)、1% ペニシリン/ストレプトマイシンから成る、内胚葉分化培地を準備 (最終濃度: 100 IU/mL と 100 μ g/mL、それぞれ) ロズウェル パーク記念研究所 1640 (追加RPMI 1640) 基礎培地。4 ° C で保存し、2 週間以内に使用します。それぞれの媒体の変更で必要なボリュームやで補うアクチビン A Wnt3a 100 ng/mL と 50 ng/mL、最終濃度でそれぞれ。 Hepatoblast 分化: 20% ノックアウト血清交換 (KSR) 0.5% 1%、1% DMSO 0.1 mM β-メルカプトエタノール 1% 非必須アミノ酸 (NEAA) L-グルタミンの代替補完から成る、hepatoblast 分化培地の準備ペニシリン/ストレプトマイシン (最終濃度 100 IU/mL と 100 μ g/mL、それぞれ) ノックアウト DMEM (KO DMEM) に追加されます。真空下でフィルターし、4 ° C で保存2 週間以内に使用します。 肝細胞の分化: 肝細胞分化培地、L-グルタミン、10 μ M ヒドロコルチゾン 21 hemisuccinate ナトリウム塩 (HCC) 1% ペニシリン/ストレプトマイシンに代わる補足 1% から成るを準備 (最終濃度 100 IU/mL と100 μ g/mL、それぞれ) HepatoZYME 培地に添加します。4 ° C で、在庫を保管し、2 週間以内使用します。HGF と OSM 必要なボリュームを補う、それぞれの媒体の変更について (最終濃度 10 ng/mL で 20 ng/mL、それぞれ)。 播種、24 h の記事は慎重にハンドヘルド電子チャネルの自動ピペット システムを使用してメディアを取り出して、100 ng/mL アクチビン A と 50 ng/mL Wnt3a と新鮮な内胚葉プライミング培の 100 μ L を追加します。注: 分化過程開始決定的な内胚葉媒体が追加されます。細胞の播種を最適化すると、細胞の分化は通常 24 h 内で開始されます。すべての媒体の変更はハンドヘルド電子チャネルの自動ピペット システムとメディアを削除して、標準で自動液体ハンドリング ディスペンサーを使用して新鮮な媒体の 100 μ L を分注した調剤カセットをチューブは、しない限り、それ以外の場合指定します。ハンドヘルド電子チャネルの自動ピペット システムは、300 μ L のヒントを使用して、よく頭 96 で使用されました。簡単に言えば、90 μ L もの細胞が付いている接触を避けるから吸気された、細胞のストレスを軽減する中型の変更時にセルを乾燥しないことが重要です。 ヒト胚性幹細胞 (hESCs)、三日間内胚葉分化培地毎日を変更します。ひと誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) の分化を実行すると、2 の余分な日だけアクチビン A を使用して決定的な内胚葉ステージを拡張します。 決定的な内胚葉誘導後、hepatoblast 仕様 KSR/DMSO 中に切り替えて、5 日間ごとに 2 日間媒体を変更します。注: 非添付も細胞数が存在する場合は、次の媒体の変更の前に 1 回血球を洗浄する以外の添加 KO DMEM を使用します。プロトコル (5 日) の第二期の期間のため、hepatoblast 仕様の最後の日の最後の 1 と 3 の中変更があります。 次の hepatoblast 分化肝細胞成熟の HepatoZYME 中に切り替えます。KSR/DMSO 中を削除した後の補足なし HepatoZYME で血球を洗浄し、10 ng/mL HGF と 20 ng/mL OSM HepatoZYME 成熟培の 100 μ L を追加します。 7 ~ 10 日間、媒体ごとの 48 h を変更します。日 18、分化、遺伝子発現と CYP P450 代謝活性を分析することによって HLCs を特徴付けます。 3. 肝細胞様の細胞組換え Laminins の区別 肝細胞特異的マーカーと免疫染色を用いた偏波マーカーの発現を検出します。 12前に説明したように CYP P450 の試金を使用して肝細胞の代謝機能をテストします。 プレートごとウェルあたりの細胞の総数を数えるプレート バリエーションを決定します。 4. 高スループット免疫細胞化学、画像集録 分化の 18 日に 1 x DPBS と 3 回洗浄、4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 50 μ L 分注によって、HLCs を修正し、15 〜 30 分間室温でインキュベートします。固定、3 回で洗い流して PBST (0.1% トゥイーン) (Ca2 +/Mg2 +) を使用せずに自動皿洗浄機。注: このセクションですべての洗浄は、特に指定しない限り、自動皿洗浄機を使用して実行します。すべての洗浄は、同じプロトコルに従って行われます。 (せずに Ca2 +/Mg2 +) PBST の 100 μ L 分注で膜を permeabilize、室温で 20 分間インキュベートします。次に、pbst; 10 %bsa の 100 μ L 分注による蛋白質のブロックを実行し、プレート シェーカーを使用して穏やかな揺れで 1 時間インキュベートします。タンパク質をブロック後、1 %bsa の 50 μ L を加えて pbst; 一次抗体を含む、プレート シェーカーを使用して穏やかな揺れで一晩, 4 ° C で。注意: 蛋白質のブロックと抗体の添加の間洗わないでください。 24 h 後 (せずに Ca2 +/Mg2 +) 1 x DPBS にて 3 回洗浄し、pbst; で 1 %bsa の 50 μ L 分注による二次抗体を追加します。暗闇の中で室温で 1 時間インキュベートします。 二次抗体の孵化後 1 x DPBS で 3 回を洗ってください。DAPI の DPBS の 50 μ L を追加 (10 μ G/ml) と暗闇の中で部屋の温度で 5-10 分間インキュベートします。 最後に、DPBS 3 回洗うし、井戸の 1 x DPBS の 100 μ L を残します。プレートは、イメージングのため準備ができています。注: プレートは、イメージングまで暗闇の中で 4 の ° C で保存する必要があります。 高コンテンツ イメージング システムを使用してプレートをイメージし、井戸の良い表現を取得するだけにいくつかのフィールドを取得します。コロンバス ソフトウェア (高コンテンツ イメージング解析システム ソフトウェア) を使用して、HLCs の別のマーカーの発現を定量化します。注: コロンバスは、細胞表現型解析のためのセル分割分析を提供しています高いコンテンツ解析ソフトウェアです。同様の結果は、CellProfiler、生物画像22の定量分析のためのオープン ソース ソフトウェアを使用して実現できます。