إنتاج شبه الآلية تتمثل مثل الخلايا من الخلايا الجذعية Pluripotent
Summary
ويصف هذا البروتوكول نهج شبه الآلي لإنتاج مثل تتمثل في الخلايا من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية في شكل لوحة جيدا 96. هذه العملية سريعة وفعالة من حيث التكلفة، مما يتيح إنتاج نوعية أكد دفعات تتمثل مثل الخلايا للبحوث الأساسية والتطبيقية في البشرية.
Abstract
وتمثل الخلايا الجذعية pluripotent البشرية مصدر متجدد للأنسجة البشرية. ابحاثنا وتركز على توليد أنسجة الكبد البشري من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (هيسكس) والناجم عن الخلايا الجذعية pluripotent (إيبسكس). إجراءات المفاضلة الحالية تولد البشرية تتمثل مثل الخلايا (عملية) عرض خليط صفات الجنين والكبار. تحسين خلية النمط الظاهري، تماما حددنا اجرائنا التمايز ومكانه الخلية، نتج عنه جيل السكان الخلية الذي عرض التعبير الجيني المحسنة ووظيفة. بينما هذه الدراسات وضع علامة على التقدم، اقتصر القدرة على توليد كميات كبيرة من لوحات متعددة جيدا للفحص بإجراءات العمل المكثف وتباين دفعة لدفعة. لمعالجة هذه القضية، قمنا بتطوير منصة شبه الآلي للتفريق بين الخلايا الجذعية pluripotent في بذر الخلية الجذعية قد. وتمايز أجريت باستخدام نظم بيبيتينج التلقائية ومناولة السائل في شكل لوحة 96-جيدا. وقد تم تحليل خلية النمط الظاهري بعد المفاضلة، استخدام الفحص المجهري الآلي ولومينوميتير جيدا من متعدد.
Introduction
وتمثل خلايا الكبد البشري الأساسي (فس) المعيار الحالي للبحوث الطبية الحيوية الكبد. على الرغم من مزاياها، فس تمثل مصدرا محدودا لخلايا الكبد ناضجة مع النمط الظاهري غير مستقرة1. الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (بتوليدا) والخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (اللجنة التوجيهية) قد اقترحت كمورد قوي للبحوث الطبية الحيوية، واعدة مصدر متجدد للأنسجة البشرية، بما في ذلك الكبد2،3،4 . الإجراءات الحالية لتمايز تتمثل توليد الخلايا التي تبدي علامات تتمثل والجينات ومهام مماثلة إلى فس3،،من45،،من67، 8،9،،من1011. في الآونة الأخيرة، باستخدام مواد محددة والمصفوفات مثل لامينينس المؤتلف، خلية تحسين النمط الظاهري وإمكانية تكرار نتائج تجريبية5،12،،من1314.
تقنيات استزراع الخلايا التقليدية تعتمد اعتماداً كبيرا على بيبيتينج اليدوي، وهي تستهلك الوقت وعرضه للخطأ. وهذا يحد من الإنتاجية المقايسة وشكل لوحة واحدة يمكن أن تعمل مع. وحتى الآن، هي معظم الدراسات التي تصف توليد عملية العمل المكثف في طبيعة وحجم صغير وبالتالي في حجم15،،من1617.
التقدم الحالي في التعامل مع السائل ونظم بيبيتينج، في تركيبة مع الفحص المجهري الآلي ومحلل مختبر، جعلت من الممكن لوضع الإجراءات التي تقلل الحاجة إلى التدخل البشري. علينا الاستفادة من هذه التكنولوجيات ووضعت نظام تمايز شبه إليه التي تولد كميات كبيرة من أنسجة الكبد البشرية الأساسية وتطبيق البحوث الطبية الحيوية. وهذا النهج يمكن أن يؤديها مع ESC البشرية والخطوط التوجيهية مع إدخال بعض التعديلات الطفيفة اللازمة، اعتماداً على خط الخلية. الجمع بين هذا النظام مع تحليل المحتوى عالية، وعلينا أن نبرهن أن ثابت قانون هنري فينوتيبينج يمكن أن تكون أقل استهلاكاً للوقت والمنجزة في نطاق18،19،،من2021.
وباختصار، أدى إلى تحسينات التشغيل الآلي لتقنيات استزراع خلية الموضحة هنا في الموثوقية وإدارة الوقت التجريبية والإنتاجية المقايسة.
Protocol
1-زرع الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية (هبسكس) “إلى 96 أيضا لوحات تتمثل التمايز” ملاحظة: أن الكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول قد أدرج في الجدول 1. يجب أن تكون الوسائط المستخدمة لهذه التجربة معقم وفي درجة حرارة الغرفة لثقافة الخلية. تستند كافة وحدات التخزين الكاشف/الحل الوارد وصفها في هذا الجزء من البروتوكول بئر واحدة من صفيحة 96-جيدا ما لم يحدد خلاف ذلك. إعداد laminin المغلفة 96 لوحات جيدا. ذوبان الجليد قنينة laminin المؤتلف 521 (100 ميكروغرام/مل) (LN-521) على 2 (ح) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تحضير حلاً 5 ميكروغرام/مل بتمييع LN-521 1 المثلج × الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس) (مع Ca2 +/Mg2 +). استخدام سائل تلقائية التعامل مع موزع مع أنبوب قياسية الاستغناء عن كاسيت لإضافة 50 ميليلتر من الحل LN-521 الواحدة من 96 لوحة جيدا جيدا.ملاحظة: حجم كل يوزع يتم تنفيذها مع موزع التعامل سائلة تلقائي مع أنبوب قياسية الاستغناء عن كاسيت، ما لم يحدد خلاف ذلك. رئيس الوزراء الحل حتى تصل إلى نهاية الاستغناء عن الكاسيت، ثم الشروع في الاستغناء عن. يمكن إعداد لوحات جيدا 96 متعددة في نفس التجربة بتكرار الإجراء عدة مرات حسب الحاجة. احتضان لوحات المغلفة LN521 في 37 °C/5% CO2 لح 2 إلى 4.ملاحظة: يمكن تخزين لوحات المغلفة LN521 إلى أسبوعين في 4 درجات مئوية. تبقى لوحات مختومة على سطح مستو لتجنب التبخر والتلوث. الاحماء العدد المطلوب من ألواح مغلفة مسبقاً في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى ح 1. نضح الحل LN-521 المتبقية من السطح المطلي باستخدام محول تطلع 8-قناة.ملاحظة: من الضروري تجنب أي اتصال مع سطح مصقول لتجنب تدهور طلاء. فورا إضافة 50 ميليلتر كل من mTeSR1 المتوسطة وتستكمل مع 10 ميكرون المرتبطة رو كيناز (روك) مثبط Y27632 جيدا والحفاظ اللوحة في الحاضنة حتى الخلية البذر في 37 °C/5% CO2.ملاحظة: لا تسمح الآبار المغلفة لامينين الجافة. إعداد تعليق خلية من 3 × 105 خلايا/مل في mTeSR1 المتوسطة وتستكمل مع 10 ميكرون روك مثبط Y27632.ملاحظة: سوف تتطلب كثافة البذر لكل خط الخلية الأمثل. نضح المتوسطة كما سبق ذكره كونفلوينسي مثقف على LN-521 من طبق بيتري مع ثقافة غير متمايزة من هبسكس في حوالي 75% إلى 85.ملاحظة: هبسكس تستزرع في قانون الجنسية-521 في mTSER1 مع المتوسط يتغير كل 24 ساعة، وباساجيد بانتظام بمجرد الخلايا تصل إلى 80 في المائة كونفلوينسي كما هو موضح سابقا12. تغسل الخلايا مع 5 مل من درجة حرارة الغرفة 1 x DPBS (دون Ca2 +/Mg2 +) وأسبيراتي المخزن المؤقت. إضافة 5 مل 1 × لطيف كاشف تفكك الخلية إلى الخلايا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 6 إلى 8 دقيقة للانفصال من الخلية.ملاحظة: لإيقاف رد فعل، دراسة مفرزة الخلايا من مصفوفة تحت المجهر. يجب أن تكون الخلايا المنفصلة جزئيا من اللوحة. إذا لم يكن الأمر كذلك، تمتد في الحضانة لاضافي 1 إلى 2 دقيقة. إنهاء رد فعل من جانب يسفط الكاشف “رقيقة خلية الانفصال” وإضافة 5 مل من mTeSR1 الطازجة المتوسطة وتستكمل مع 10 ميكرون روك مثبط Y27632 للخلايا. استخدام مكشطة خلية رفع الخلايا من المصفوفة وماصة صعودا وهبوطاً عدة مرات باستخدام تلميح P1000 لمزيج. عد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام هيموسيتوميتير استناداً إلى تريبان الأزرق تلطيخ أسلوب الاستبعاد وإعداد تعليق خلية مع التركيزات المطلوبة. “الماصة؛” العدد المطلوب من الخلايا في أنبوب الطرد مركزي 15 مل أو 50 مل عقيمة وتدور الخلايا أسفل طريق سينتريفوجينج لهم في 115 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.ملاحظة: مطلوب 5 مل متوسطة mTeSR1 التي تحتوي على 3 × 105 خلايا/مل للوحة واحدة 96 جيدا، لخط الخلية H9. نضح المادة طافية ولطف ريسوسبيند بيليه الخلية حتى يتم الحصول على حل متجانسة في 37 درجة مئوية في المتوسط mTeSR1 وتستكمل مع 10 ميكرون روك مثبط Y27632.ملاحظة: ينصح باستخدام المانع روك كما أنه يحسن خلية بقاء وظيفة إعادة طلاء. إضافة 50 ميليلتر من تعليق خلية على لوح جيدا 96 التي تحتوي على 50 ميليلتر من mTeSR1 مع 10 ميكرون روك مثبط Y27632. بعد البذر، العودة اللوحات للحاضنة الخلية في 37 °C/5% CO2 ل 24 ساعة للسماح للخلايا لإرفاق. فحص الخلايا في اليوم التالي وسحب المانع روك متى تم إنشاء جهة الاتصال خلية بخلية. في كونفلوينسي 40%، قم بالتبديل إلى التمايز المتوسطة (الشكل 1B).ملاحظة: إذا كانت الخلية كونفلوينسي أعلى من 40%، اللوحات ليست مناسبة للتمايز HLC مع خط الخلية H9. 2-التفريق بين هبسكس إلى الخلايا مثل تتمثل في “لامينينس المؤتلف” في “لوحات جيدا” 96 يعد التفريق بين العوامل المتوسطة والنمو. إعداد البشرية أضافت الأسهم الحل (100 ميكروغرام/مل) بإذابة مسحوق A أضافت البشرية في العقيمة 0.2% البقري ألبومين المصل (BSA) في برنامج تلفزيوني. قاسمة المخزون والمخزن في-20 درجة مئوية. استخدم في 1:1، 000. إعداد الماوس Wnt3a الأسهم الحل (10 ميكروغرام/مل) بإذابة مسحوق Wnt3a الماوس في العقيمة 0.2% جيش صرب البوسنة. قاسمة المخزون والمخزن في-20 درجة مئوية. استخدم 1: 200. إعداد تتمثل البشرية عامل النمو (هجف) حل الأسهم (10 ميكروغرام/مل) بإذابة مسحوق هجف البشرية في العقيمة 0.2% جيش صرب البوسنة. قاسمة المخزون والمخزن في-20 درجة مئوية. استخدم 1: 1000. تحضير حل م Oncostatin (OSM) الأسهم (20 ميكروغرام/مل) بإذابة المسحوق في العقيمة 0.2% جيش صرب البوسنة. قاسمة المخزون والمخزن في-20 درجة مئوية. استخدم في 1:1، 000. الأنسجة نهائي: إعداد متوسطة تمايز الأنسجة، يتألف من الملحق 2% B27 (50 س، دون الأنسولين)، 1% البنسلين/ستربتوميسين (تركيزات النهائي: 100 وحدة دولية/مل و 100 ميكروغرام/مل، على التوالي) إضافة إلى (1640 معهد ميموريال بارك روزويل ربمي 1640) متوسطة القاعدية. تخزين في 4 درجات مئوية، واستخدم خلال أسبوعين. عند كل تغيير المتوسطة، الملحق وحدة التخزين المطلوب مع أضافت A و Wnt3a بتركيز نهائي من 100 نانوغرام/مل و 50 نانوغرام/مل، على التوالي. التفريق هيباتوبلاست: إعداد هيباتوبلاست متوسطة التمايز، تتألف من 20% خروج المغلوب المصل الاستبدال (قصر)، 0.5% تكملة بديل للأم الجلوتامين، الأحماض الأمينية غير الأساسية 1% (نيا)، مم 0.1 بيتا-mercaptoethanol، [دمس] 1% و 1% البنسلين/ستربتوميسين (تركيزات النهائية في 100 وحدة دولية/مل و 100 ميكروغرام/مل، على التوالي) إضافة إلى خروج المغلوب دميم (كو-دميم). تصفية تحت الفراغ وتخزينها في 4 درجات مئوية. استخدم خلال أسبوعين. تتمثل التمايز: إعداد متوسطة التمايز تتمثل، تتكون من % 1 الملحق كبديل للأم الجلوتامين، ملح 10 ميكرون الهيدروكورتيزون، 21-هيميسوكسيناتي الصوديوم (العقود)، 1% البنسلين/ستربتوميسين (تركيزات النهائية في 100 وحدة دولية/مل و 100 ميكروغرام/مل، على التوالي) إضافة إلى المتوسطة هيباتوزيمي. تخزين المخزون عند 4 درجة مئوية، وتستخدم خلال أسبوعين. لكل تغيير المتوسطة، تكملة الحجم المطلوب مع هجف و OSM (تركيزات النهائية في 10 نانوغرام/مل و 20 نانوغرام/ملليلتر، على التوالي). ح 24 وظيفة البذر، إزالة المتوسطة باستخدام نظام ماصة تلقائية قناة إلكترونية المحمولة باليد وإضافة 100 ميليلتر من الطازجة فتيلة الأنسجة المتوسطة وتستكمل مع 100 نانوغرام/مليلتر أضافت A و 50 نانوغرام/مل Wnt3a بعناية.ملاحظة: تبدأ عملية التمايز حالما تم إضافة المتوسطة الأنسجة نهائي. مجرد خلية البذر هو الأمثل، هو بدأ التمايز الخلوي عادة خلال 24 ساعة. متوسطة جميع التغييرات تتم عن طريق إزالة المتوسطة مع نظام ماصة تلقائية قناة إلكترونية المحمولة باليد والاستغناء عن 100 ميليلتر من متوسطة جديدة باستخدام موزع معالجة سائل تلقائي مع معيار أنبوب كاسيت الاستغناء عن ما لم خلاف ذلك المحدد. تم استخدام نظام ماصة تلقائية قناة إلكترونية المحمولة باليد مع 96 البئر، باستخدام 300 ميليلتر النصائح. وباختصار، كان يستنشق ميليلتر 90 من أيضا تجنب أي اتصال مع الخلايا، ومن المهم أن لا تجف الخلايا أثناء تغيير المتوسطة للحد من التوتر الخلية. بالنسبة للخلايا الجذعية الجنينية البشرية (هيسكس) تغيير وسيلة تمايز الأنسجة يوميا لمدة ثلاثة أيام. إذا كان يتم إجراء المفاضلة للخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسكس)، تمديد المرحلة الأنسجة نهائي لأيام إضافية 2 استخدام أ أضافت فقط. بعد التعريفي الأنسجة نهائياً، قم بالتبديل إلى قصر/[دمس] المتوسطة لمواصفات هيباتوبلاست، وتغيير المتوسطة كل يومين لمدة 5 أيام.ملاحظة: إذا كان هناك عدد من الخلايا غير مرفقة في البئر، استخدم كو-دميم غير تكملة لغسل الخلايا مرة واحدة قبل تغيير المتوسطة القادمة. نظراً لمدة المرحلة الثانية من البروتوكول (5 أيام)، تكون هناك تغييرات متوسطة 3 مع آخر واحد في اليوم الأخير من مواصفات هيباتوبلاست. وبعد التفريق بين هيباتوبلاست، قم بالتبديل إلى المتوسطة هيباتوزيمي للنضج تتمثل. تغسل الخلايا مرة واحدة مع هيباتوزيمي دون الملحق بعد إزالة كسر/[دمس] متوسطة وإضافة 100 ميليلتر متوسطة النضج هيباتوزيمي تكملة مع 10 نانوغرام/مل هجف و 20 نانوغرام/مليلتر OSM. تغيير المتوسطة كل 48 ساعة لمدة 7 إلى 10 أيام. في يوم 18 من المفاضلة، تميز عملية من خلال تحليل التعبير الجيني والنشاط الأيضي CYP P450. 3. وصف تتمثل تشبه الخلايا “المتمايزة في المؤتلف لامينينس” الكشف عن التعبير عن علامات محددة تتمثل وعلامات الاستقطاب باستخدام إيمونوستينينج. اختبار وظيفة التمثيل الغذائي تتمثل باستخدام فحوصات CYP P450 كما هو موضح قبل12. تحديد التباين لوحة، عد العدد الإجمالي للخلايا في البئر للوحة الواحدة. 4-إيمونوسيتوتشيميستري عالية الإنتاجية والحصول على الصور في يوم 18 من التمايز، غسل الآبار ثلاث مرات مع 1 x DPBS، إصلاح عملية عن طريق الاستغناء عن ميليلتر 50 من 4% بارافورمالدهيد (PFA)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 30 دقيقة. بعد تثبيت البرنامج، يغسل ثلاث مرات مع ببست (0.1% توين) (دون Ca2 +/Mg2 +) غسالة لوحة تلقائي استخدام.ملاحظة: يغسل جميع في هذا المقطع يتم تنفيذها باستخدام غسالة لوحة تلقائية ما لم يحدد خلاف ذلك. يغسل جميع القيام به في أعقاب البروتوكول نفسه. بيرميبيليزي الغشاء بالاستغناء عن ميليلتر 100 من ببست (دون Ca2 +/Mg2 +) واحتضانها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، القيام بحجب البروتين بالاستغناء عن ميليلتر 100 من جيش صرب البوسنة 10% في ببست واحتضانها ح 1 في الهز لطيف شاكر لوحة استخدام. بعد عرقلة البروتين، إضافة 50 ميليلتر من جيش صرب البوسنة 1% في ببست التي تحتوي على الأجسام المضادة الأولية، واحتضان في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها مع الهز لطيف شاكر لوحة استخدام.ملاحظة: عدم غسل بين إضافة كتلة وأضداد البروتين. بعد 24 ساعة، تغسل ثلاث مرات مع x DPBS 1 (بدون Ca2 +/Mg2 +) وإضافة الأجسام المضادة الثانوية بالاستغناء عن ميليلتر 50 من جيش صرب البوسنة 1% في ببست. احتضان ح 1 في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد الاحتضان جسم الثانوية، يغسل 3 مرات مع 1 x DPBS. إضافة 50 ميليلتر من دببس مع DAPI (10 ميكروغرام/مل)، واحتضان لمدة 5 – 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. وأخيراً، يغسل 3 مرات مع دببس وترك 100 ميليلتر من 1 x DPBS في البئر. لوحات جاهزة للتصوير.ملاحظة: يجب تخزين لوحات في 4 درجات مئوية في الظلام حتى التصوير. صورة اللوحة باستخدام نظام تصوير عالية المحتوى، والحصول على العديد من المجالات عبر البئر للحصول على تمثيل جيد للبئر. التحديد الكمي للتعبير عن علامات مختلفة في عملية باستخدام البرمجيات كولومبوس (برنامج نظام تحليل “التصوير” عالية المحتوى).ملاحظة: كولومبوس هو برنامج تحليل المحتوى عالية، الذي يقدم تحليل تجزئة الخلية للخلية فينوتيبينج. يمكن الحصول على نتائج مماثلة باستخدام سيلبروفيلير، برمجيات المصدر المفتوح للتحليل الكمي للصور البيولوجية22.
Representative Results
تم إجراء تمايز الخلية باستخدام خط خلايا الجذعية جنينية (H9). واستخدم منصة شبه الآلي لتفرق وتميز الخلايا (الشكل 1A). استخدمت موزع معالجة سائل تلقائي معطف مصفوفة والبذور الخلايا المفردة. وبدأ التمايز الخلوي عند الخلايا بلغت 40% كونفلوينسي (يوم 0). وأجريت تغييرات الوسائط باستخدام نظام ماصة تلقائية قناة إلكترونية محمولة باليد لإزالة المتوسطة وموزع معالجة السائل لإضافة المتوسط (الشكل 1A). تثبيت الخلية وتلطيخ أجريت باستخدام موزع التلقائي معالجة السائل في تركيبة مع الغسالة لوحة التلقائية. وأجريت التصوير والتحديد الكمي باستخدام نظام التصوير عالية-المحتوى والبرمجيات كولومبوس. وتم قياس نشاط السيتوكروم P450 مقايسة المنشأة باستخدام. وبعد الاحتضان الركازة، خلية supernatants كانت تحصد والإضاءة الحيوية المسجلة باستخدام قارئ ميكروسكوبية المتعدد (الشكل 1A). وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت الطوري التقليدية لقياس التغيرات في مورفولوجيا الخلايا وخلال تتمثل التمايز (الشكل 1B). في يوم 18، جرت دراسة التغير في عدد الخلايا بين الآبار عقب DAPI تلطيخ (الشكل 2A). تم القبض على سبعة حقول لعرض كل بئر وعدد الأنوية كمياً (الشكل 2A). ونحن في الكشف عن أية فروق إحصائية بين الآبار بمتوسط ±3 41,662، خلايا 366 كل بئر (الشكل 2). في يوم 18، قد كانت ثابتة والملون لعلامات نموذجية تتمثل (الشكل 3أ-ز) واختبار للنشاط CYP P450. قد أعرب عن علامات تتمثل مثل HNF4α (89.2% ±2 الخلايا إيجابية)، القلب (الخلايا إيجابية ±6 92.8%)، ووكالة فرانس برس (الخلايا إيجابية ±2 61.8 في المائة). أيضا قد أعرب البروتينات CYP P450، CYP2D6 و CYP3A4 وعرض مظهر مضلع متميزة كما هو مبين بتعبير البروتين كادهيرين ه. وتم قياس نشاط عملية CYP P450 في يوم 18. قد أظهرت النشاط CYP1A2 في ±45 295,906، 828 رلو/مل/ملغ من البروتين و CYP3A في 1,066,112 ±177، 416 ملغ/رلو/مل من البروتين (الشكل 3 ح). رقم 1: تمايز تتمثل من PSCs في 96 تنسيق جيد- (أ). الرسم التخطيطي للمعدات المستخدمة لأتمتة شبه التمايز الخلوي والتثبيت وتلطيخ، والتصوير والأنشطة الفنية. (ب)- الممثل التغيرات في مورفولوجيا الخلوية خلال التمايز ثابت قانون هنري. باختصار، هي جاهزة PSCs تجاه الأنسجة نهائي، تليها مواصفات هيباتوبلاست تميزت بعرض حصاة كبيرة تشبه مورفولوجيا الخلايا وقبل نضوج تتمثل مع الخلايا الحصول على شكل مضلع. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- رقم 2: تقييم عملية بئر للتغير. (أ) تمثيل 96 أيضا لوحة عرض لعملية ملطخة DAPI. مقياس بار = 1- (ب) التحديد الكمي لعدد الخلايا في البئر. متوسط عدد الخلايا في الآبار في أعمدة (أعلى) وصفوف (أسفل)، من سبعة مجالات لآراء كل جيدا ومحددة كمياً باستخدام البرمجيات كولومبوس. هو عدد متوسط الخلايا عبر اللوحة 41,662 3,366 ± SEM الخلايا كل بئر. ولوحظت لم توجد فروق معتد بها إحصائيا بين الآبار. كان يعمل One-way ANOVA مع توكي في الوظيفة المخصصة الاختبارات الإحصائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3: قياس النشاط CYP P450 في عملية في يوم 18 وتتمثل علامة التعبير. (أ) النسبة المئوية تتمثل العامل النووي 4 ألفا (HNF4α) تعبير ± SEM يستند إلى ثلاثين بئرا مطلة على عشرة حقول لكل بئر. (ب) النسبة المئوية للتعبير الزلال (القلب) +/–ووزارة شؤون المرأة، تستند إلى آبار منفصلة 3 مطلة على عشرة حقول لكل بئر. (ج) النسبة المئوية لألفا فيتوبروتين (وكالة فرانس برس) +/-وزارة شؤون المرأة يستند إلى آبار منفصلة 3 مطلة على عشرة حقول لكل بئر. (د) هاء-كادهيرين تلطيخ. (ﻫ) تلطيخ CYP2D6. (و) تلطيخ CYP3A4. (ز)-غلوبيولين مناعي G (IgG) تلطيخ التحكم. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ح) CYP P450 1A2 و 3A النشاط الأيضي في عملية في يوم 18. يمثل البيانات البيولوجية ستة يتطابق +/-“نشاط sem.” هو قوله/mL وحدات خفيفة نسبيا (رلوس) كل 1 ملغ بروتين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
لدينا الإجراء شبه الآلي فعالة وموثوقة واقتصادية، مما يتيح إنتاج عملية في المقياس (الشكل 1). لم يكن هناك أي اختلاف كبير من حيث عدد الخلايا بين الآبار في اللوحة، مما يجعل هذا البرنامج نهجاً مناسباً للفرز على أساس الخلية (الشكل 2). وبالإضافة إلى ذلك، تمكن شبه أتمتة سير العمل المستخدم لإنتاج إعداد كبيرة من لوحات في وقت واحد، الذي لم يكن ممكناً قبل استخدام العمليات اليدوية5،12.
الأهم من ذلك، عملية الأتمتة لا يؤثر على غلة التمايز، مع غالبية الخلايا معربا عن HNF4α (89.2% ±2) والقلب (92.8% ±6) (الشكل 3). أيضا قد أعرب إنزيمات CYP P450 CYP2D6 و CYP3A4 وعرض النشاط الأيضي CYP1A2 و CYP3A مماثلة للسابقة التجارب المبلغ عنها (الشكل 3)5. على الرغم من توحيد معايير البروتوكول، كونفلوينسي الخلية قبل التفريق بين أمر حاسم لنقي HLC التمايز. ولذلك، كفالة توزيع خلية جيدة عبر البئر اعتبار هام (الشكل 1). وقد ثبت أن هذا الخط خلية يتوقف، وبالتالي التحسين البذر وكثافة الخلايا المطلوبة لكل خلية قبل خط الارتقاء.
في شكله الحالي، هذا المنبر ليست مناسبة لإنتاج كميات كبيرة من عملية للتطبيقات السريرية، وسيتحقق هذا على الأرجح عن طريق استخدام الخلية المصانع والمفاعلات الحيوية. ومع ذلك، تسمح المنهجية التي وضعت لتوليد خلايا الكبد البشري السريع للمرض نمذجة وفحص المخدرات و/أو المخدرات repurposing الدراسات. وعلاوة على ذلك، الفحص قابلة للإرسال المتعدد، تسمح بتوليد مجموعات البيانات مولتيباراميتريك لتحليل الميكانيكية. تسير إلى الأمام، ونحن نعتقد أيضا أن هذه التكنولوجيا يمكن أن تطبق على نظم أكثر تعقيداً في المختبر مثل التمايز 3D أو كمنصة لتحسين HLC النمط الظاهري في المختبر.
وفي الختام، نعتقد أن لدينا نظام بسيط وشبه الآلي زيادة الإنتاجية التجريبية، وتقليل التباين التجريبية، وبالتالي تحسين نوعية مجموعات البيانات البيولوجية وعلى استقراء اتجاه الفسيولوجيا البشرية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل مع جوائز من مكتب رئيس العلماء (TCS/16/37)، ومنحة الدكتوراه لجنة نهر الميكونج.
Materials
| 405 LS Washer | Biotek | ||
| B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
| Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
| GripTips for VIAFLO 96 | Integra | 6434 | |
| HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
| mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermoFisher | 5840300 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
| Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
| Standard tube dispensing cassette | ThermoFisher | 24072670 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette | Integra | 6001 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 1.00496 EMD MILLIPORE | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
| P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Antibodies | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
| Alpha-fetoprotein | Abcam | ab3980 | 1:500 (mouse) |
| CYP2D6 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
| CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
| HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
| E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
| IgG | DAKO | 1:400 | |
| Anti-Mouse 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11001 | 1:400 |
| Anti-sheep 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11015 | 1:400 |
| Anti-rabbit 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11008 | 1:400 |
References
- Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory. J Hepatol. 62 (1, Supplement), S157-S169 (2015).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 170-182 (2016).
- Szkolnicka, D., Lucendo-Villarin, B., Moore, J. K., Simpson, K. J., Forbes, S. J., Hay, D. C. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Transl Med. 5 (6), 764-772 (2016).
- Choudhury, Y., et al. Patient-specific hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells model pazopanib-mediated hepatotoxicity. Sci Rep. 7, 41238 (2017).
- Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (6), 1250-1262 (2015).
- Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
- Takayama, K., et al. Prediction of interindividual differences in hepatic functions and drug sensitivity by using human iPS-derived hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16772-16777 (2014).
- Takayama, K., et al. 3D spheroid culture of hESC/hiPSC-derived hepatocyte-like cells for drug toxicity testing. Biomaterials. 34 (7), 1781-1789 (2013).
- Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells Dayt Ohio. 26 (4), 894-902 (2008).
- Iii, R. L. G., et al. Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture. PLOS ONE. 9 (1), e86372 (2014).
- Chen, Y. -. F., Tseng, C. -. Y., Wang, H. -. W., Kuo, H. -. C., Yang, V. W., Lee, O. K. Rapid generation of mature hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells by an efficient three-step protocol. Hepatol Baltim Md. 55 (4), 1193-1203 (2012).
- Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. JoVE J Vis Exp. (121), e55355 (2017).
- Takayama, K., et al. Long-Term Self-Renewal of Human ES/iPS-Derived Hepatoblast-like Cells on Human Laminin 111-Coated Dishes. Stem Cell Rep. 1 (4), 322-335 (2013).
- Kanninen, L. K., et al. Laminin-511 and laminin-521-based matrices for efficient hepatic specification of human pluripotent stem cells. Biomaterials. , 86-100 (2016).
- Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 141-148 (2014).
- Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387 (Supplement C), 1-9 (2017).
- Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
- Grimm, F. A., Iwata, Y., Sirenko, O., Bittner, M., Rusyn, I. High-Content Assay Multiplexing for Toxicity Screening in Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes and Hepatocytes. Assay Drug Dev Technol. 13 (9), 529-546 (2015).
- Bray, M. -. A., et al. A dataset of images and morphological profiles of 30,000 small-molecule treatments using the Cell Painting assay. GigaScience. , (2017).
- Pradip, A., et al. High Content Analysis of Human Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes Reveals Drug Induced Steatosis and Phospholipidosis. Stem Cells Int. 2016, 2475631 (2016).
- Donato, M. T., Gómez-Lechón, M. J., Tolosa, L. Using high-content screening technology for studying drug-induced hepatotoxicity in preclinical studies. Expert Opin Drug Discov. 12 (2), 201-211 (2017).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
Cite This Article
Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (137), e57995, doi:10.3791/57995 (2018).