Produzione semi-automatizzata di Hepatocyte come cellule staminali pluripotenti

1. cellule staminali pluripotenti (hPSCs) in 96 ben piastre per Hepatocyte differenziazione di semina Nota: I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo protocollo è stato elencati nella tabella 1. I supporti utilizzati per questo esperimento devono essere sterile e a temperatura ambiente per la coltura cellulare. Se non diversamente specificato, tutti i volumi di soluzione di reagente, descritti in questa parte del protocollo si basano su un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Preparare laminin verniciato a 96 pozzetti. Scongelare una fiala di laminina ricombinante 521 (100 µ g/mL) (LN-521) per 2 h per una notte a 4 ° C. Preparare una soluzione di 5 µ g/mL diluendo LN-521 ghiacciata 1 x soluzione tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) (con Ca2 +/Mg2 +). Utilizzare un liquido automatico movimentazione erogatore con un tubo standard cassetta di erogazione per aggiungere 50 µ l della soluzione LN-521 per pozzetto di una piastra ben 96.Nota: Tutto il volume dispensa vengono eseguite con un dispenser automatico dei liquidi con un tubo standard cassetta di erogazione, se non diversamente specificato. Privilegiata la soluzione fino a quando raggiunge la fine erogazione della cassetta, quindi procedere per erogare. Più di 96 pozzetti possono essere preparati nello stesso esperimento ripetendo la procedura tante volte quanto necessario. Incubare le piastre rivestite con LN521 a 37 °C/5% CO2 per 2-4 h.Nota: Piastre rivestite con LN521 possono essere conservati fino a due settimane a 4 ° C. Tenere le piastre sigillate su una superficie piana per evitare l’evaporazione e contaminazione. Scaldare il numero richiesto di prepatinato piastre a 37 ° C per 30 min a 1 h. Aspirare la soluzione di LN-521 restante della superficie verniciata utilizzando un adattatore di aspirazione 8 canali.Nota: È fondamentale per evitare il contatto con la superficie rivestita per evitare il degrado del rivestimento. Immediatamente aggiungere 50 µ l di mTeSR1 supplementato con inibitore di 10 µM Rho-collegata della chinasi (ROCK) Y27632 e mantenere la piastra nell’incubatore fino semina a 37 °C/5% CO2cellulare.Nota: Non lasciare asciugare i pozzetti rivestite con laminina. Preparare una sospensione di cellule di 3 x 105 cellule/mL in mTeSR1 supplementato con inibitore di 10 µM ROCK Y27632.Nota: La densità di semina per ogni linea cellulare richiedono ottimizzazione. Aspirare il mezzo da una capsula di Petri con una cultura indifferenziata di hPSCs a circa 75% a 85% confluency coltivati su LN-521 come precedentemente descritto12.Nota: hPSCs sono coltivate su LN-521 in mTSER1 con il mezzo cambiato ogni 24 h e attraversate regolarmente una volta che le cellule raggiungono l’80% dei confluency come descritto in precedenza12. Lavare le cellule con 5 mL di temperatura 1 x DPBS (senza Ca2 +/Mg2 +) e aspirare il buffer. Aggiungere 5 mL di 1x delicato reagente di dissociazione delle cellule alle cellule e incubare a 37 ° C per 6-8 min per dissociazione delle cellule.Nota: Per interrompere la reazione, esaminare il distacco delle cellule dalla matrice sotto il microscopio. Le cellule dovrebbero essere parzialmente disconnesso dalla piastra. In caso contrario, estendere l’incubazione per un min di 1 o 2 extra. Terminare la reazione aspirando il reagente delicata delle cellule dissociazione e aggiungere 5 mL di mTeSR1 fresco supplementato con inibitore di ROCK Y27632 di 10 µM per le cellule. Usare un raschietto di cella per sollevare le cellule dalla matrice e pipetta su e giù utilizzando una punta di P1000 più volte per mescolare. Contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro basato su macchiatura metodo di esclusione del blu di Trypan e preparare la sospensione cellulare con concentrazioni necessarie. Pipettare il numero desiderato di cellule in una provetta da centrifuga da 15 mL o 50 mL sterile e rallentare le cellule mediante centrifugazione li a 115 x g per 5 min a temperatura ambiente.Nota: Per un 96 ben piatto, 5 mL di mezzo di mTeSR1 che contiene 3 x 105 cellule/mL è necessaria per la linea cellulare H9. Aspirare il supernatante e Risospendere delicatamente il cellulare fino ad ottenuta una soluzione omogenea a 37 ° C in mTeSR1 supplementato con inibitore di 10 µM ROCK Y27632.Nota: L’uso dell’inibitore di roccia è consigliato come migliora la sopravvivenza post ri-placcatura delle cellule. Aggiungere 50 µ l della sospensione delle cellule sulla piastra ben 96 contenente 50 µ l di mTeSR1 con inibitore di 10 µM ROCK Y27632. Dopo la semina, riporre le piastre nell’incubatore di cella a 37 °C/5% CO2 per 24 h permettere alle cellule di allegare. Esaminare le cellule il giorno successivo e prelevare inibitore di roccia, una volta stabilito il contatto cellula-cellula. Al 40% confluency, passare a mezzo di differenziazione (Figura 1B).Nota: Se confluency di cella è superiore al 40%, le piastre non sono adatte per la differenziazione di HLC con la linea cellulare H9. 2. differenziazione hPSCs per Hepatocyte-come le cellule su laminine ricombinante in 96 ben piastre Preparare la differenziazione crescita media e fattori. Preparare soluzione stock di activina A umana (100 µ g/mL) di dissoluzione umana activina A polvere in sterile 0,2% albumina di siero bovino (BSA) in PBS. Aliquotare il brodo e conservare a-20 ° C. Utilizzare 1:1, 000. Preparare soluzione stock mouse Wnt3a (10 µ g/mL) di dissoluzione del mouse Wnt3a polvere in sterile 0,2% di BSA. Aliquotare il brodo e conservare a-20 ° C. Utilizzare a 1: 200. Preparare soluzione di riserva (HGF) di fattore di crescita dell’epatocita umano (10 µ g/mL) di dissoluzione umana HGF polvere in sterile 0,2% di BSA. Aliquotare il brodo e conservare a-20 ° C. Utilizzare a 1: 1000. Preparare soluzione stock Oncostatin M (OSM) (20 µ g/mL) sciogliendo la polvere in sterile 0,2% di BSA. Aliquotare il brodo e conservare a-20 ° C. Utilizzare 1:1, 000. Endoderma definitivo: preparare mezzo di differenziazione endoderma, che consiste di 2% B27 supplemento (50 x, senza insulina), 1% di penicillina/streptomicina (concentrazioni finali: 100 UI/mL e 100 µ g/mL, rispettivamente) aggiunto al Roswell Park Memorial Institute 1640 ( RPMI 1640) medio basale. Conservare a 4 ° C e consumare entro due settimane. Ad ogni cambio medio, integrare il volume richiesto con activina A e Wnt3a alla concentrazione finale di 100 ng/mL e 50 ng/mL, rispettivamente. Hepatoblast differenziazione: preparare mezzo di differenziazione hepatoblast, costituito da sostituzione di 20% ad eliminazione diretta del siero (KSR), 0,5% alternativa supplemento di L-Glutammina, 1% non essenziali aminoacidi (NEAA), 0,1 mM beta-mercaptoetanolo, 1% DMSO e 1% penicillina/streptomicina (concentrazioni finali a 100 IU/mL e 100 µ g/mL, rispettivamente) aggiunto a knockout DMEM (KO-DMEM). Filtrare sotto vuoto e conservare a 4 ° C. Utilizzare entro due settimane. Differenziazione dell’epatocita: preparare mezzo di differenziazione dell’epatocita, costituito da 1% un’alternativa supplemento di L-Glutammina, sale di 10 µM idrocortisone 21-emisuccinato sodico (HCC), 1% di penicillina/streptomicina (concentrazioni finali a 100 IU/mL e 100 µ g/mL, rispettivamente) aggiunto al medium HepatoZYME. Conservare il brodo a 4 ° C e utilizzare entro due settimane. Per ogni cambiamento medio, integrare il volume richiesto con HGF e OSM (concentrazioni finali a 10 ng/mL e 20 ng/mL, rispettivamente). 24h post semina, con attenzione rimuovere il mezzo utilizzando un sistema di pipetta automatica dei canali elettronici portatili e aggiungere 100 µ l di fresco endoderma-adescamento supplementato con 100 ng/mL activina A e 50 ng/mL Wnt3a.Nota: Il processo di differenziazione inizia una volta che è stato aggiunto il supporto di endoderma definitivo. Una volta semina delle cellule è ottimizzato, la differenziazione cellulare viene avviata normalmente entro 24 ore. Tutte le medie, le modifiche vengono eseguite rimuovendo il mezzo con un sistema di pipetta automatica dei canali elettronici portatili e 100 µ l di terreno fresco utilizzando un dispenser automatico dei liquidi con uno standard di erogazione tubo erogazione cassetta a meno che non altrimenti specificato. Con una testa, con 300 µ l punte 96 è stato utilizzato un sistema di pipetta automatica dei canali elettronici portatili. In breve, 90 µ l sono stati aspirati dal bene evitando qualsiasi contatto con le cellule, ed è importante non asciugare le cellule durante il cambiamento medio per ridurre lo stress cellulare. Per cellule staminali embrionali umane (hESC), cambiare il mezzo di differenziazione endoderma ogni giorno per tre giorni. Se la differenziazione viene eseguita per le cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs), è possibile estendere la fase di endoderma definitivo 2 giorni extra utilizzando activina A solo. Dopo induzione endoderma definitivo, passare al mezzo di KSR/DMSO per hepatoblast specifica e modificare il mezzo ogni 2 giorni per 5 giorni.Nota: Se ci sono un numero di cellule non iscritti nel pozzo, utilizzare non integrati KO-DMEM per lavare le cellule una volta prima del prossimo cambio medio. A causa della durata della seconda fase del protocollo (5 giorni), ci saranno 3 cambi medi con l’ultimo l’ultimo giorno della specifica hepatoblast. In seguito la differenziazione hepatoblast, passare a HepatoZYME mezzo per maturazione dell’epatocita. Lavare le cellule una volta con HepatoZYME senza il supplemento dopo aver tolto di mezzo KSR/DMSO e aggiungere 100 µ l di terreno di maturazione HepatoZYME completato con HGF 10 ng/mL e 20 ng/mL OSM. Modificare il mezzo ogni 48 h per 7-10 giorni. Al giorno 18 della differenziazione, caratterizzano HLCs analizzando l’espressione genica e l’attività metabolica CYP P450. 3. caratterizzazione del Hepatocyte-come cellule differenziate su ricombinante laminine Rilevare l’espressione di marcatori specifici dell’epatocita e di polarizzazione usando immunostaining. Testare la funzione metabolica degli epatociti, facendo uso delle analisi di CYP P450 come descritto prima delle12. Determinare la variazione di piastra, contando il numero totale di cellule per pozzetto per piastra. 4. high Throughput immunocitochimica e acquisizione di immagini Il giorno 18 di differenziazione, lavare i pozzetti tre volte con 1 x DPBS, difficoltà il HLCs erogazione 50 µ l di paraformaldeide al 4% (PFA) e incubare a temperatura ambiente per 15-30 min. Dopo la fissazione, lavare tre volte con PBST (0.1% tween) (senza Ca2 +/Mg2 +) utilizzando un lavatore automatico del piatto.Nota: Tutti i lavaggi in questa sezione vengono eseguite utilizzando un lavatore automatico del piatto, se non diversamente specificato. Tutti i lavaggi sono fatta seguendo lo stesso protocollo. Permeabilize la membrana di erogazione 100 µ l di PBST (senza Ca2 +/Mg2 +) e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, eseguire il blocco della proteina di erogazione 100 µ l di 10% BSA in PBST e incubare per 1 h in agitazione delicata utilizzando un agitatore per piastre. Dopo proteina bloccando, aggiungere 50 µ l di 1% BSA in PBST contenente gli anticorpi primari, incubare per una notte a 4 ° C con agitazione delicata utilizzando un agitatore per piastre.Nota: Non lavare tra aggiunta di blocco e l’anticorpo di proteina. Dopo 24 h, lavare tre volte con 1 x DPBS (senza Ca2 +/Mg2 +) e aggiungere l’anticorpo secondario di erogazione 50 µ l di 1% BSA in PBST. Incubare 1h a temperatura ambiente al buio. Dopo l’incubazione anticorpo secondario, lavare 3 volte con 1 x DPBS. Aggiungere 50 µ l di DPBS con DAPI (10 µ g/mL) e incubare per 5 – 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Infine, lavare 3 volte con DPBS e lasciare 100 µ l di 1 x DPBS nel pozzo. Le piastre sono pronte per l’imaging.Nota: Piastre devono essere conservate a 4 ° C al buio fino a formazione immagine. La piastra di immagine utilizzando un sistema di imaging ad alto contenuto e acquisire diversi campi attraverso il pozzo per ottenere una buona rappresentazione del pozzo. Quantificare l’espressione dei diversi marcatori nel HLCs utilizzando software di Columbus (Imaging ad alto contenuto di software di sistema di analisi).Nota: Columbus è un software di analisi dei contenuti ad alta, che offre analisi di segmentazione di cellule per fenotipizzazione delle cellule. Risultati simili possono essere raggiunti utilizzando CellProfiler, un software open-source per l’analisi quantitativa di immagini biologiche22.