Produção semi-automática do hepatócito como células de células-tronco pluripotentes

1. semeadura de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em 96 bem as placas de hepatócitos diferenciação Nota: Os reagentes e equipamentos utilizados neste protocolo foi listado na tabela 1. Meios usados para esta experiência devem ser esterilizado e na temperatura de quarto para cultura de células. Todos os volumes de reagente/solução descritos nesta parte do protocolo são baseados em um único poço de uma placa de 96 poços, a menos que especificado de outra forma. Preparar laminina revestido 96 placas bem. Descongelar um frasco de laminina recombinante 521 (100 µ g/mL) (LN-521) por 2 h durante a noite a 4 ° C. Prepare uma solução de 5 µ g/mL, diluindo-se LN-521 na gelada 1 x fosfato salino de Dulbecco (DPBS) (com Ca2 +/ mg2 +). Use um líquido automático dispensador de manipulação com um tubo padrão gaveta de distribuição para adicionar 50 µ l da solução LN-521 por alvéolo de um prato bem 96.Nota: Todo volume dispensa são executadas com um distribuidor de manipulação automática do líquido com um tubo padrão gaveta de distribuição, a menos que especificado de outra forma. Prime a solução até atingir o final dispensação da fita e, em seguida, prossiga para dispensar. Múltiplas 96 placas bem podem ser preparadas no mesmo experimento, repetindo o processo quantas vezes for necessário. Incube as placas revestidas LN521 em 37 °C/5% CO2 para 2 a 4 h.Nota: Placas com revestimento em LN521 podem ser armazenadas duas semanas a 4 ° C. Mantenha as placas seladas em uma superfície plana para evitar a evaporação e contaminação. Aquecer o número necessário de placas pré-revestidas a 37 ° C por 30 min a 1 h. Aspire a solução LN-521 restante da superfície revestida, usando um adaptador de aspiração de 8 canais.Nota: É fundamental para evitar qualquer contato com a superfície revestida, para evitar a degradação do revestimento. Imediatamente adicione 50 μL por poço de mTeSR1 suplementado com inibidor de quinase Rho-associado (ROCK) 10 µM Y27632 e manter a placa na incubadora até a célula semeadura em 37 °C/5% CO2.Nota: Não permitem os poços laminina-revestidos secar. Prepare uma suspensão de células de 3 x 105 células/mL em mTeSR1 suplementado com inibidor ROCK 10 µM Y27632.Nota: A densidade de semeadura para cada linhagem celular exigirá a otimização. Aspire o meio de uma placa de Petri com uma cultura diferenciada de hPSCs em cerca de 75% a 85% confluência cultivada na LN-521 conforme descrito anteriormente12.Nota: hPSCs são cultivadas na LN-521, em mTSER1, com o médio mudou a cada 24h e passadas regularmente, uma vez que as células alcançar 80% de confluência como descrito anteriormente,12. Lavar as células com 5 mL de temperatura 1 x DPBS (sem o Ca2 +/ mg2 +) e aspire o buffer. Adicionar 5 mL de 1x gentil eritrócito de dissociação para as células e incubar a 37 ° C por 6 a 8 min para dissociação de célula.Nota: Para parar a reação, examine o desprendimento das células da matriz sob o microscópio. As células devem ser parcialmente desconectadas da placa. Se assim não for, estender a incubação por um extra 1 a 2 min. Terminar a reação aspirando o reagente gentil dissociação celular e adicionar 5 mL de mTeSR1 fresco suplementado com 10 µM ROCK inibidor da Y27632 para as células. Utilize um raspador de célula para levantar as células da matriz e da pipeta e descer usando uma dica P1000 várias vezes para misturar. Contar as células viáveis usando um hemocytometer baseado no azul Trypan método de exclusão de coloração e preparar a suspensão de células com concentrações necessárias. Pipetar o número desejado das células para um tubo de centrífuga de 15 mL ou 50 mL estéril e girar as células para baixo por centrifugação-los a 115 x g durante 5 min à temperatura ambiente.Nota: Para uma 96 placa bem, 5 mL de meio de mTeSR1, contendo 3 x 105 células/mL é necessário para a linha de celular H9. Aspirar o sobrenadante e suavemente Ressuspender as células até à obtenção de uma solução homogênea a 37 ° C em mTeSR1 suplementado com inibidor ROCK 10 µM Y27632.Nota: O uso de inibidor ROCK é recomendado como melhora a célula sobrevivência post re-chapeamento. Adicione 50 µ l de suspensão de célula na chapa bem 96 contendo 50 µ l de mTeSR1 com inibidor ROCK 10 µM Y27632. Após a semeadura, entregue as chapas para a incubadora de célula em 37 °C/5% CO2 por 24 h permitir que as células anexar. Examinar as células no dia seguinte e retirar inibidor ROCK, uma vez que estabeleceu o contato de uma célula para outra. Na confluência de 40%, alterne para o meio de diferenciação (figura 1B).Nota: Se a confluência de célula é superior a 40%, as placas não são adequadas para diferenciação de HLC com a linha de celular H9. 2. diferenciação hPSCs de hepatócitos células na Laminins recombinante em 96 placas bem Prepare a diferenciação de fatores de crescimento e meio. Prepare o humano Activin A solução (100 µ g/mL), dissolvendo o pó de Activin A humana em estéril 0,2% albumina de soro bovino (BSA) em PBS. Alíquota do estoque e loja a-20 ° C. Usar em 1:1, 000. Prepare a solução do mouse (10 µ g/mL) Wnt3a dissolvendo o pó de Wnt3a de rato em estéril 0,2% de BSA. Alíquota do estoque e loja a-20 ° C. Usar em 1: 200. Prepare a solução humana hepatócito (10 µ g/mL) fator de crescimento (HGF) dissolvendo-se pó HGF humano em estéril 0,2% de BSA. Alíquota do estoque e loja a-20 ° C. Usar em 1: 1000. Prepare a solução Oncostatin M (OSM) (20 µ g/mL), dissolvendo o pó em estéril 0,2% de BSA. Alíquota do estoque e loja a-20 ° C. Usar em 1:1, 000. Endoderme definitivo: preparar o meio de diferenciação de endoderme, consistindo de suplemento de 2% B27 (50 x, sem insulina), 1% penicilina/estreptomicina (concentrações finais: 100 UI/mL e 100 µ g/mL, respectivamente) adicionado a Roswell Park Memorial Institute 1640 ( RPMI 1640) meio basal. Armazenar a 4 ° C e uso dentro de duas semanas. Em cada mudança de média, completar o volume necessário com A Activin e Wnt3a na concentração final de 100 ng/mL e 50 ng/mL, respectivamente. Hepatoblast diferenciação: preparar o hepatoblast meio de diferenciação, constituído por substituição de 20% de soro de nocaute (KSR), 0,5% alternativa suplemento de L-glutamina, 1% não aminoácidos essenciais (timina), 0.1 mM beta-Mercaptoetanol, DMSO 1% e 1% penicilina/estreptomicina (concentrações finais em 100 UI/mL e 100 µ g/mL, respectivamente) adicionado ao nocaute DMEM (KO-DMEM). Filtrar sob vácuo e armazenar a 4 ° C. Use dentro de duas semanas. Diferenciação do hepatócito: preparar o meio de diferenciação de hepatócitos, consistindo de 1%, uma alternativa suplemento de L-glutamina, 10 µM hidrocortisona 21-hemisuccinate sal de sódio (HCC), 1% penicilina/estreptomicina (concentrações finais em 100 UI/mL e 100 µ g/mL, respectivamente) adicionado ao meio de HepatoZYME. Armazenar o estoque a 4 ° C e uso dentro de duas semanas. Para cada alteração média, completar o volume necessário com HGF e OSM (concentrações finais em 10 ng/mL e 20 ng/mL, respectivamente). post de 24 h, semeadura, cuidadosamente remova o meio usando um sistema de pipeta automática de canais eletrônicos portáteis e adicionar 100 µ l de fresco endoderme-ferragem suplementado com 100 ng/mL A Activin e Wnt3a de 50 ng/mL.Nota: O processo de diferenciação começa uma vez que o meio de endoderme definitivo foi adicionado. Uma vez que a célula semeadura é otimizado, a diferenciação celular é iniciada normalmente dentro de 24 h. Médio de todas as alterações são executadas, removendo o meio com um sistema de pipeta automática de canais eletrônicos portáteis e 100 µ l de meio fresco, utilizando um dispensador de manipulação automática do líquido com um padrão de distribuição do tubo gaveta distribuidora a menos que caso contrário especificado. Utilizou-se um sistema de pipeta automática de canais eletrônicos portáteis com um 96 bem cabeça, uso de 300 µ l dicas. Em breve, 90 µ l foram aspirado do bem evitando qualquer contato com as células, e é importante para não secar as células durante a mudança de médio para reduzir o stress celular. Para células-tronco embrionárias humanas (hESCs), altere o meio de diferenciação endoderme diariamente por três dias. Se a diferenciação é realizada por células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSCs), estenda a fase definitiva endoderme por 2 dias extras usando Activin A apenas. Após a indução da endoderme definitivo, alterne para meio de KSR/DMSO para especificação de hepatoblast e mudar o médio a cada 2 dias durante 5 dias.Nota: Se houver um número de células não-inscritos no poço, use KO-DMEM não completadas para lavar as células uma vez antes da próxima mudança de médio. Devido a duração da segunda fase do protocolo (5 dias), haverá 3 alterações médias com o último no último dia da especificação hepatoblast. Após a diferenciação de hepatoblast, alterne para o HepatoZYME médio para maturação do hepatócito. Lavar as células uma vez com HepatoZYME sem o suplemento após a remoção média KSR/DMSO e adicionar 100 µ l de meio de maturação HepatoZYME suplementado com 10 ng/mL HGF e 20 ng/mL OSM. Mude o meio cada 48 h por 7 a 10 dias. No dia 18 da diferenciação, caracteriza HLCs, analisando a expressão gênica e atividade metabólica CYP P450. 3. caracterização do hepatócito, como células diferenciadas na Laminins recombinante Detecta a expressão de marcadores específicos do hepatócito e marcadores de polarização usando immunostaining. Teste de função metabólica de hepatócito usando CYP P450 ensaios conforme descrito antes12. Determine a variação de placa, contando o número total de células por poço por placa. 4. alto Throughput imunocitoquímica e aquisição de imagem No dia 18 de diferenciação, lavar os poços três vezes com 1 x DPBS, os HLCs pela distribuidora 50 µ l de paraformaldeído 4% (PFA) e incubar a temperatura ambiente por 15 a 30 min. Após a fixação, lavar três vezes com PBST (0.1% tween) (sem o Ca2 +/ mg2 +) usando uma anilha de chapa automática.Nota: Todas as lavagens nesta seção são realizadas usando uma anilha de chapa automático, a menos que especificado de outra forma. Todas as lavagens são feitas seguindo o mesmo protocolo. Permeabilize a membrana pela distribuidora 100 µ l de PBST (sem o Ca2 +/ mg2 +) e incube por 20 min em temperatura ambiente. Em seguida, executar o bloqueio de proteína por aplicadora 100 µ l de 10% BSA em PBST e incubar durante 1 h em agitação suave, utilizando um agitador de placa. Após bloqueio de proteína, adicionar 50 µ l de 1% de BSA em PBST contendo os anticorpos primários, incubar a 4 ° C durante a noite com agitação suave, utilizando um agitador de placa.Nota: Não lave entre adição de bloco e anticorpo da proteína. Após 24h, lavar três vezes com 1 x DPBS (sem o Ca2 +/ mg2 +) e adicione o anticorpo secundário por aplicadora 50 µ l de 1% de BSA em PBST. Incube a 1h à temperatura ambiente no escuro. Após a incubação do anticorpo secundário, lave 3 vezes com 1 x DPBS. Adicionar 50 µ l de DPBS com DAPI (10 µ g/mL) e incubar durante 5 a 10 min à temperatura ambiente no escuro. Finalmente, lavar 3 vezes com DPBS e deixar 100 µ l de 1 x DPBS no poço. As placas estão prontas para a imagem latente.Nota: As placas devem ser armazenadas a 4 ° C, no escuro até a imagem. A placa de imagem usando um sistema de imagens de alto teor e adquirir vários campos do outro lado do poço para obter uma boa representação do poço. Quantificar a expressão dos marcadores diferentes nos HLCs usando software de Colombo (alto teor Imaging software de sistema de análise).Nota: Colombo é um software de análise de conteúdo elevado, que oferece análise de segmentação celular para fenotipagem de células. Resultados semelhantes podem ser obtidos usando CellProfiler, um software open-source para análise quantitativa de imagens biológicas22.