Producción semi automatizada de hepatocitos como células de células madre pluripotentes

1. siembra de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) en 96 bien las placas de hepatocitos diferenciación Nota: Reactivos y equipos utilizados en el presente Protocolo ha sido incluido en la tabla 1. Medios utilizados para este experimento deben ser estéril y a temperatura ambiente para el cultivo celular. Todos los volúmenes de reactivo solución descritos en esta parte del Protocolo se basan en un único pozo de una placa de 96 pocillos, a menos que se especifique lo contrario. Preparar laminina cubierto 96 placas bien. Descongelar un vial de laminina recombinante 521 (100 μg/mL) (LN-521) por 2 h para toda la noche a 4 ° C. Preparar una solución de 5 μg/mL diluyendo LN-521 en la helada 1 x tamponada con fosfato solución salina de Dulbecco (DPBS) (con Ca2 +/Mg2 +). Utilizar un manejo dispensador con un tubo estándar cassette de dispensación de líquidos automática para añadir 50 μl de la solución de LN-521 por pozo de una placa bien 96.Nota: Todo el volumen dispensa se realizan con un dispensador automático de manejo de líquidos con un tubo estándar cassette de dispensación a menos que se especifique lo contrario. Prime la solución hasta que llegue el dispensación final del cassette, luego proceda a dispensar. Múltiples placas bien 96 se pueden preparar en el mismo experimento repitiendo el procedimiento tantas veces como sea necesario. Incubar las placas de LN521-revestido en 37 °C/5% CO2 para 2 a 4 h.Nota: Las placas revestidas de LN521 pueden ser almacenadas dos semanas a 4 ° C. Mantener las placas de sellado sobre una superficie plana para evitar la evaporación y contaminación. Caliente el número requerido de placas Prelacados a 37 ° C por 30 min a 1 h. Aspire la solución de LN-521 restante de la superficie recubierta con un adaptador de aspiración de 8 canales.Nota: Es fundamental para evitar el contacto con la superficie recubierta para evitar la degradación de la capa. Inmediatamente añadir 50 μL por pocillo mTeSR1 suplementado con inhibidor de cinasa Rho-associated (roca) de 10 μm Y27632 y mantenga la placa en la incubadora hasta la siembra en 37 °C/5% CO2de la célula.Nota: No permita que los pocillos recubiertos de laminina secar. Preparar una suspensión de 3 x 105 células/mL en mTeSR1 suplementado con inhibidor de roca de 10 μm Y27632.Nota: La densidad de siembra para cada línea celular requieren de optimización. Aspirar el medio de una placa Petri con una cultura no diferenciada de hPSCs en cerca de 75% a 85% confluencia cultivada en LN-521, como describió anteriormente12.Nota: hPSCs se cultivan en LN-521, en mTSER1 con el medio cambiado cada 24 h y pasados regularmente una vez que las células alcancen el 80% de confluencia como se describió anteriormente12. Lavar las células con 5 mL de temperatura ambiente 1 x DPBS (sin Ca2 +/Mg2 +) y aspirar el búfer. Añadir 5 mL de 1 x suave reactivo de disociación celular a las células e incubar a 37 ° C durante 6 a 8 min de disociación celular.Nota: Para detener la reacción, examinar la separación de las células de la matriz bajo el microscopio. Las células deben ser parcialmente separadas de la placa. Si no, prolongar la incubación por un minuto extra de 1 a 2. Termine la reacción aspirando el reactivo de disociación celular suave y añadir 5 mL de mTeSR1 frescas, suplementado con inhibidor de roca 10 μm Y27632 a las células. Use un raspador celular para las células de la matriz y la pipeta hacia arriba y abajo usando una punta de P1000 varias veces para mezclar. Contar las células viables usando un hemocitómetro basado en exclusión tinción de azul de tripano y preparar la suspensión de células con concentraciones requeridas. Pipetear la cantidad deseada de las células en un tubo de centrífuga de 15 mL o 50 mL estéril y desactivación de las células por centrifugación a 115 x g durante 5 min a temperatura ambiente.Nota: Para la placa bien uno 96, 5 mL de medio de mTeSR1 con 3 x 105 células/mL se requiere para la línea de celular H9. Aspirar el sobrenadante y resuspender suavemente el precipitado de células hasta obtener una solución homogénea a 37 ° C en mTeSR1 suplementado con inhibidor de roca de 10 μm Y27632.Nota: Se recomienda el uso de inhibidor de la roca pues mejora celular supervivencia post re-galjanoplastia. Añadir 50 μl de la suspensión de células en la placa bien 96 con 50 μl de mTeSR1 con el inhibidor de roca de 10 μm Y27632. Después de la siembra, devolver las placas a la incubadora de la célula a 37 °C/5% CO2 durante 24 h permitir que las células a conectar. Examinar las células al día siguiente y retirar el inhibidor de la roca una vez que se ha establecido el contacto célula a célula. En el 40% de confluencia, cambie a medio de diferenciación (figura 1B).Nota: Si la confluencia celular es superior a 40%, las placas no son adecuadas para la diferenciación de CLH con la línea de celular H9. 2. diferenciar hPSCs hepatocitos como células en Lamininas recombinante en 96 placas bien Preparar la diferenciación de factores de crecimiento y medio. Prepare humano Activin A solución (100 μg/mL) disolviendo polvo de activina A humanos en estéril 0.2% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS. Alícuota del caldo y almacenar a-20 ° C. Utilizar en el 1:1, 000. Prepare el ratón Wnt3a solución (10 μg/mL) por disolución de ratón Wnt3a polvo en BSA 0,2% estéril. Alícuota del caldo y almacenar a-20 ° C. Utilizar 1: 200. Prepare el hepatocito humano del factor de crecimiento (HGF) solución (10 μg/mL) disolviendo polvo HGF humano en BSA 0,2% estéril. Alícuota del caldo y almacenar a-20 ° C. Utilizar al 1: 1000. Preparar la solución stock de Oncostatina M (OSM) (20 μg/mL) disolviendo el polvo en BSA 0,2% estéril. Alícuota del caldo y almacenar a-20 ° C. Utilizar en el 1:1, 000. Endodermo definitivo: preparar medio de diferenciación de endodermo, que consiste en 2% B27 suplemento (x 50, sin insulina), el 1% de penicilina/estreptomicina (concentraciones finales: 100 UI/mL y 100 μg/mL, respectivamente) a Roswell Park Memorial Institute 1640 ( RPMI 1640) medio basal. Almacenar a 4 ° C y usar dentro de dos semanas. En cada cambio de medio, completar el volumen requerido con la activina A y Wnt3a en concentración final de 100 ng/mL y de 50 ng/mL, respectivamente. Hepatoblast diferenciación: preparar medio de diferenciación de hepatoblast, que consiste en reemplazo de suero 20% nocaut (KSR), 0.5% alternativa complemento de L-glutamina, 1% los de aminoácidos no esenciales (AANE), 0.1 mM beta-mercaptoetanol, DMSO 1% y 1% penicilina/estreptomicina (concentraciones finales de 100 UI/mL y 100 μg/mL, respectivamente) a nocaut DMEM (KO-DMEM). Filtrar al vacío y almacenar a 4 ° C. Utilizar dentro de dos semanas. Diferenciación del hepatocito: preparar medio de diferenciación del hepatocito, consisten en 1% alternativa complemento de L-glutamina, 10 μm hidrocortisona hemisuccinato 21 sodio sal (HCC), el 1% de penicilina/estreptomicina (concentraciones finales en 100 UI/mL y 100 μg/mL, respectivamente) añadido al medio de HepatoZYME. Almacenar el stock a 4 ° C y usar dentro de dos semanas. Para cada cambio de medio, completar el volumen requerido con HGF y OSM (concentraciones finales de 10 ng/mL y 20 ng/mL, respectivamente). 24 h post siembra, cuidadosamente Quite el medio utilizando un sistema de pipeta automática de canales electrónicos portátiles y añada 100 μl del endodermo-cebado dulce suplementado con 100 ng/mL A activina y Wnt3a de 50 ng/mL.Nota: El proceso de diferenciación comienza una vez que se ha agregado el medio del endodermo definitivo. Una vez que siembra celular está optimizado, la diferenciación celular se inicia normalmente en 24 h. Medio los cambios se realizan quitando el medio con un sistema de pipeta automática de canales electrónicos mano y dispensar 100 μl de medio fresco usando un dispensador automático de manejo de líquidos con un estándar tubo dispensador cinta a menos que lo contrario especificado. Se utiliza un sistema de pipeta automática de canales electrónicos portátiles con una cabeza del pozo, utilizando 300 μL puntas 96. En Resumen, 90 μl fueron aspirados de la bien evitando cualquier contacto con las células, y es importante no secar las células durante el cambio de medio para reducir el estrés celular. Para células de vástago embrionarias humanas (hESCs), cambiar el medio de la diferenciación del endodermo diariamente durante tres días. Si se realiza la diferenciación de las células madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSCs), ampliar la etapa de endodermo definitivo para 2 días extras uso de activina A sólo. Después de la inducción del endodermo definitivo, cambie a medio KSR/DMSO para la especificación de hepatoblast y cambiar el medio cada 2 días durante 5 días.Nota: Si hay un número de células no inscritos en el pozo, use KO-DMEM sin suplemento para lavar las células una vez antes del siguiente cambio de medio. Debido a la duración de la segunda etapa del Protocolo (5 días), habrá 3 cambios medio con la última de ellas en el último día de la especificación hepatoblast. Siguiendo la diferenciación de hepatoblast, interruptor en medio HepatoZYME para maduración de hepatocitos. Lavar las células una vez con HepatoZYME sin el suplemento después de quitar medio KSR/DMSO y añadir 100 μl de HepatoZYME maduración suplementado con 10 ng/mL HGF y 20 ng/mL OSM. Cambiar el medio cada 48 h durante 7 a 10 días. En el día 18 de la diferenciación, caracterizar HLCs mediante el análisis de la expresión génica y actividad metabólica P450 CYP. 3. Caracterización de los hepatocitos como células diferenciadas en Lamininas recombinante Detectar la expresión de marcadores específicos de hepatocito y polarización mediante inmunotinción. Prueba de función metabólica del hepatocito mediante ensayos de CYP P450 como se describe antes de las12. Determinar la variación de la placa, contando el número total de células por pocillo por placa. 4. alto rendimiento Immunocytochemistry y la adquisición de la imagen El día 18 de diferenciación, lavar los pocillos 3 veces con 1 x DPBS arreglar las HLCs dispensar 50 μl del 4% paraformaldehido (PFA) e incube a temperatura ambiente durante 15 a 30 min. Después de la fijación, lavar tres veces con SAFT (0,1% tween) (sin Ca2 +/Mg2 +) utilizando una arandela de placa automático.Nota: Todos lavados en esta sección se realizan utilizando una arandela de placa automático a menos que se especifique lo contrario. Todos los lavados se realizan siguiendo el mismo protocolo. Permeabilizar la membrana por dispensar 100 μl de SAFT (sin Ca2 +/Mg2 +) e incubar durante 20 min a temperatura ambiente. A continuación, realizar el bloqueo de la proteína por dispensar 100 μl de BSA de 10% en SAFT e incubar durante 1 h en suave agitación con un agitador de placa. Después de bloquear la proteína, añada 50 μl de 1% de BSA en SAFT que contiene los anticuerpos primarios, incubar a 4 ° C durante la noche con suave agitación con un agitador de placa.Nota: No lave entre bloque y anticuerpos además de proteína. Después de 24 h, lavar tres veces con 1 x DPBS (sin Ca2 +/Mg2 +) y añadir el anticuerpo secundario por dispensar 50 μl de 1% de BSA en SAFT. Incubar 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la incubación del anticuerpo secundario, lavar 3 veces con 1 x DPBS. Añadir 50 μl de DPBS con DAPI (10 μg/mL) e incúbelo durante 5 – 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Por último, lavar 3 veces con DPBS y dejar 100 μl de 1 x DPBS en el pozo. Las placas están listas para la proyección de imagen.Nota: Las placas deben almacenarse a 4 ° C en la oscuridad hasta la proyección de imagen. Imagen de la placa mediante un sistema de proyección de imagen de alto contenido y adquirir varios campos en el pozo para obtener una buena representación del pozo. Cuantificar la expresión de los diferentes marcadores en el HLCs mediante software de Columbus (software de sistema de análisis de imágenes alto contenido).Nota: Colón es un software de análisis de contenido de alta, que ofrece análisis de segmentación de la célula para el fenotipado de la célula. Resultados similares se pueden lograr mediante el uso de CellProfiler, un software de código abierto para el análisis cuantitativo de imágenes biológicas22.