זיהוי של GTPase Prenylation קטן ו GTP איגוד באמצעות ממברנה Fractionation ו GTPase-מקושרים Immunosorbent Assay
Summary
כאן נתאר פרוטוקול לחקור את prenylation ואת guanosine-5′-טריפוספט (GTP)-טעינה של GTPase רו. פרוטוקול זה מורכב משתי שיטות מפורט, כלומר assay ממברנה fractionation ו- immunosorbent של GTPase-מקושרים. הפרוטוקול יכול לשמש כדי למדוד את prenylation ואת GTP העמסת שונים GTPases קטנים אחרים.
Abstract
משפחת רו GTPase שייך superfamily ראס וכוללת כ-20 חברים בבני אדם. Rho GTPases חשובים בוויסות תאיים מגוונים, כולל cytoskeletal dynamics, תנועתיות תא, התא קוטביות, הדרכה עצב, סחר vesicular בקרה מחזור התא. שינויים ב- Rho GTPase איתות תפקיד חיוני הרגולציה של מצבים פתולוגיים רבים, כגון סרטן, מחלות מערכת העצבים המרכזית, מחלות מערכת החיסון תלוית. שינוי posttranslational של GTPases רו (קרי, prenylation על ידי intermediates מסלול mevalonate) ואיגוד GTP הם גורמי מפתח אשר משפיעים ההפעלה של חלבון זה. בנייר זה, שתי שיטות פשוטות וחיוני ניתנים לגילוי של prenylation מגוון רחב של רו GTPase ופעילויות איגוד GTP. הפרטים של ההליכים טכני כי שימשו מוסברים צעד אחר צעד בכתב היד.
Introduction
רו GTPases הם קבוצה של חלבונים קטנים (21-25 kDa), אשר ההכפלה שמורים היטב במהלך האבולוציה, בצורה של תת ייחודי superfamily Ras של GTPases קטן. כל תת משפחה בתוך superfamily הזה, יש גרעין משותף G תחום מעורב של GTPase פעילות נוקלאוטיד exchange1. ההבדל בין המשפחה רו את subfamilies ראס אחרים הוא הנוכחות של “תחום הוספה רו” בתוך סטרנד βth 5, סליל αth 4 את תחום GTPase קטן2.
בהתבסס על הסיווג האחרונות, רו GTPases נחשבים משפחה של איתות חלבונים שמתאימים לתוך superfamily GTPase בראס3. GTPases Rho יונקים יש 22 חברים המבוסס על התפקוד המסוים שלהם אפיון כללי4 שבה RhoA, Rac1 ו- Cdc42 הם בין בני למד ביותר בקבוצה זו. Rho GTPases מקושרות אל תאיים איתות המסלולים באמצעות מנגנון מוסדר באופן הדוק אשר תלויה מתגים מולקולריים באמצעות חלבון שינויים posttranslational5.
GTP טעינה, הידרוליזה מנגנונים חיוניים במחזור הפעלה/ביטול הפעלה של GTPases רו קטן והם מוסדרים באמצעות הפעלת GTPase חלבונים (רווחים). פערים אחראים הידרוליזה GTP, לעבוד ביחד עם גואנין נוקלאוטיד exchange גורמים (GEFs) אשר אחראים על התגובה GTP-טעינה. התמ ג רו דיסוציאציה מעכבי (GDIs) לספק עוד יותר רגולציה של רו GTPases קטנים באמצעות איגוד GTPases רו התמ ג מכורך. זה מעכב את התמ ג דיסוציאציה ואסטמה ומקילה על sequestering של GTPases רו קטן מן האתרים פעיל ממברנה תאיים. יש גם עוד יותר רגולציה של חלבונים רו GTPase המערבים את prenylation של GDIs המסדירה נוקלאוטיד הידרוליזה של exchange והן פקדי התמ ג/GTP רכיבה על אופניים1,6,7,8.
GTP-טעינה והן GTPase רו prenylation מעורבים בתנועה של GTPase רו בין ציטוזול קרום התא על-ידי שינוי המאפיינים lipophilic של אלה חלבונים1,9. הרגולטורים הנ ל אינטראקציה עם פוספוליפידים של קרום התא וחלבונים modulating אחרים מתוך התמ ג/GTP המרת פעילות10. יתר על כן, GDIs, מעכבי דיסוציאציה, לחסום את הידרוליזה GTP והן ההחלפה התמ ג/GTP. GDIs לעכב את הדיסוציאציה של החלבונים רו לא פעילים מן התמ ג ו, לכן, האינטראקציה שלהם עם effectors במורד הזרם. GDIs גם לווסת את המחזוריות של GTPases בין ציטוזול קרום התא. הפעילות של רו GTPases תלויה במידה רבה את תנועתם אל קרום התא; לפיכך, GDIs נחשבים הרגולטורים קריטי זה יכול sequester GTPases בציטופלסמה דרך מסתיר את אזור הידרופובי/תחומים11,12.
עבור GTPase רו יש אופטימלי איתות ותפקוד בשלבים השונים של מחזור ההפעלה שלה, מחזור דינמי של הידרוליזה GTP-טעינה/GTP היא קריטית. כל סוג של שינויים בתהליך זה עלול לגרום השינויים הבאים בפונקציות תא מווסתות על-ידי רו GTPase, כגון תא קוטביות, התפשטות, מורפוגנזה, ציטוקינזה, הגירה, אדהזיה והישרדות13,14.
בפרוטוקול הנוכחי מספק לקוראים שיטה מפורטת כדי לפקח קטן RhoA GTPase הפעלה דרך החקירה של prenylation שלהם, התמ ג/GTP טעינה. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לזהות את GTP ואיגוד של מגוון רחב של GTPases קטן, prenylation. וזמינותו GTPase-מקושרים immunosorbent יכול לשמש כדי למדוד את רמת ההפעלה של סוגים אחרים של GTPases, כגון Rac1, Rac2, Rac3, H-, קיי- או N-ראס, הב ו רו15. סימבסטטין סוכן תרופתי משמש כדוגמה, כפי שדווח לאחרונה להיות מעורב ברגולציה של קטן GTPase רו prenylation ופעילות8,9,14,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים שיטה מדויקת למדוד קטן GTPase prenylation ואיגוד GTP כמוצג GTPase קטן subcellular לוקליזציה (ממברנה לעומת ציטוזול) ו GTP רו טעינה. GTPases קטנים באים לידי ביטוי התאים האיקריוטים, ממלאים תפקידים חיוניים ב תאית שגשוג, תנועתיות ומבנה. Prenylation ואיגוד GTP מעורבים בוויסות פעילות GTPase; לכן, מבחני כדי להערי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
איציק רז Ghavami נתמכה על ידי בריאות מדע מרכז ההפעלה מענק, CHRIM ההפעלה מענק מחקר מניטובה החדש החוקר הפועלים גרנט. . ג’אבד אליזאדה נתמכה על ידי מניטובה מחקר studentship. דאגה Shojaei נתמך על ידי מענק בריאות קרן המדע פועל להאיץ MITACS הבתר. עאדל רזאא’י מוגדם נתמכה על ידי NSERC הפועלים גרנט אשר נערך על ידי ג’וסף וו גורדון. אמיר א Zeki נתמכה על ידי כל הפרס NIH/NHLBI K08 (1K08HL114882-01A1). מארק ג’ לוס בחביבות מודה התמיכה של NCN להעניק #2016/21/B/NZ1/02812, נתמך על ידי LE ביבליקום המכון ללימודים מתקדמים (אזור מרכז-ואל דה לה לואר, צרפת) דרך חכמה הלואר עמק כללי תוכנית שלה והיתה שותפה במימון מאת מארי פעולות Sklodowska-קירי, להעניק #665790. סימון דה סילבה רוזה נתמכה על ידי UMGF studentship.
Materials
| DMEM high Glucose | VWR (Canada) | VWRL0101-0500 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR (Canada) | CA45001-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR (Canada) | 97062-806 | |
| EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CA71007-118 | |
| EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CAAAJ60767-AE | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | VWR (Canada) | CA97061-340 | |
| Ammonium Persulfate | VWR (Canada) | CABDH9214-500G | |
| Tris-Hydroxymethylaminomethane | VWR (Canada) | CA71009-186 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Biorad (Canada) | 1610158 | |
| TEMED | Biorad (Canada) | 1610801 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma/Aldrich (Canada) | P8340-5ML | 1:75 dilution |
| Rho-GTPase Antibody Sampler Kit | Cell Signaling (Canada) | 9968 | 1:1000 dilution |
| Pan-Cadherin antibody | Cell Signaling (Canada) | 4068 | 1:1000 dilution |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology (USA) | sc-69778 | 1:3000 dilution |
| RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format) | Cytoskeleton Inc. (USA) | BK121 | Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016. |
| RhoA Antibody | Cell Signaling | 2117 | |
| ECL | Amersham-Pharmacia Biotech | RPN2209 | |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibody | Sigma | A6154-1ML | |
| SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | 1612071A | Spectrophotometer |
| Nonidet P-40 | Sigma | 11332473001 | non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol |
| DMSO | Sigma | D8418-50ML | |
| PBS | Sigma | P5493-1L | |
| Phophatase Inhibitor cocktail | Sigma | P5726-5ML | 1:75 Dilution |
References
- Yeganeh, B., et al. Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease, cancer and pulmonary disease. Pharmacology & Therapeutics. 143 (1), 87-110 (2014).
- Valencia, A., Chardin, P., Wittinghofer, A., Sander, C. The ras protein family: evolutionary tree and role of conserved amino acids. Biochemistry. 30 (19), 4637-4648 (1991).
- Hall, A. Rho family GTPases. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1378-1382 (2012).
- Rojas, A. M., Fuentes, G., Rausell, A., Valencia, A. The Ras protein superfamily: evolutionary tree and role of conserved amino acids. The Journal of Cell Biology. 196 (2), 189-201 (2012).
- Cherfils, J., Zeghouf, M. Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs. Physiological Reviews. 93 (1), 269-309 (2013).
- Shojaei, S., et al. Perillyl Alcohol (Monoterpene Alcohol), Limonene. Enzymes. 36, 7-32 (2014).
- Ghavami, S., et al. Airway mesenchymal cell death by mevalonate cascade inhibition: integration of autophagy, unfolded protein response and apoptosis focusing on Bcl2 family proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (7), 1259-1271 (2014).
- Alizadeh, J., et al. Mevalonate Cascade Inhibition by Simvastatin Induces the Intrinsic Apoptosis Pathway via Depletion of Isoprenoids in Tumor Cells. Scientific Reports. 7, 44841 (2017).
- Ghavami, S., et al. Mevalonate cascade regulation of airway mesenchymal cell autophagy and apoptosis: a dual role for p53. PLoS One. 6 (1), e16523 (2011).
- Tang, Y., Olufemi, L., Wang, M. T., Nie, D. Role of Rho GTPases in breast cancer. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 759-776 (2008).
- DerMardirossian, C., Bokoch, G. M. GDIs: central regulatory molecules in Rho GTPase activation. Trends in Cell Biology. 15 (7), 356-363 (2005).
- Garcia-Mata, R., Boulter, E., Burridge, K. The ‘invisible hand’: regulation of RHO GTPases by RHOGDIs. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 493-504 (2011).
- Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
- Ghavami, S., et al. Geranylgeranyl transferase 1 modulates autophagy and apoptosis in human airway smooth muscle. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L420-L428 (2012).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-535 (2000).
- Ghavami, S., et al. Statin-triggered cell death in primary human lung mesenchymal cells involves p53-PUMA and release of Smac and Omi but not cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta. 1803 (4), 452-467 (2010).
- Cordle, A., Koenigsknecht-Talboo, J., Wilkinson, B., Limpert, A., Landreth, G. Mechanisms of statin-mediated inhibition of small G-protein function. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34202-34209 (2005).
- Waiczies, S., Bendix, I., Zipp, F. Geranylgeranylation but not GTP-loading of Rho GTPases determines T cell function. Science Signaling. 1 (12), pt3 (2008).
- Waiczies, S., et al. Geranylgeranylation but not GTP loading determines rho migratory function in T cells. Journal of Immunology. 179 (9), 6024-6032 (2007).
- Satori, C. P., Kostal, V., Arriaga, E. A. Review on Recent Advances in the Analysis of Isolated Organelles. Analytica Chimica Acta. 753, 8-18 (2012).
- Berndt, N., Sebti, S. M. Measurement of protein farnesylation and geranylgeranylation in vitro, in cultured cells and in biopsies, and the effects of prenyl transferase inhibitors. Nature Protocols. 6 (11), 1775-1791 (2011).
- Keely, P. J., Conklin, M. W., Gehler, S., Ponik, S. M., Provenzano, P. P. Investigating integrin regulation and signaling events in three-dimensional systems. Methods in Enzymology. 426, 27-45 (2007).
- Oliver, A. W., et al. The HPV16 E6 binding protein Tip-1 interacts with ARHGEF16, which activates Cdc42. British Journal of Cancer. 104 (2), 324-331 (2011).
- Moniz, S., Matos, P., Jordan, P. WNK2 modulates MEK1 activity through the Rho GTPase pathway. Cellular Signalling. 20 (10), 1762-1768 (2008).
