الكشف عن برينيليشن جتباسي صغيرة وأنشئ ملزمة باستخدام تجزئة غشاء ومقايسة الممتز GTPase مرتبطة
Summary
هنا يمكننا وصف بروتوكول للتحقيق في برينيليشن وجانسين-5 ‘-ثلاثي الفوسفات (غتب)-تحميل”جتباسي رو”. يتألف هذا البروتوكول من أسلوبي مفصلة، إلا وهي وجود الغشاء والممتز GTPase مرتبطة الاعتداء. البروتوكول يمكن استخدامها لقياس برينيليشن وأنشئ تحميل مختلفة أخرى جتباسيس الصغيرة.
Abstract
تنتمي إلى فوق عائلة رأس الأسرة GTPase رو ويضم حوالي 20 عضوا في البشر. جتباسيس رو هامة في تنظيم الوظائف الخلوية المتنوعة، بما في ذلك ديناميكية cytoskeletal، حركية الخلية، الخلية القطبية، التوجيه محواري والاتجار حويصلية ومراقبة دورة الخلية. التغييرات في إشارة “جتباسي رو” دوراً جوهريا تنظيمية في العديد من الحالات المرضية، مثل السرطان، وأمراض الجهاز العصبي المركزي، وتعتمد على نظام المناعة من الأمراض. تعديل بوستترانسلاشونال “جتباسيس رو” (أي، برينيليشن بوسيطة مسار mevalonate) وأنشئ الملزمة هي العوامل الرئيسية التي تؤثر على تنشيط هذا البروتين. في هذه الورقة، يتم توفير طريقتين أساسية وبسيطة للكشف نطاق واسع من “جتباسي رو” برينيليشن وأنشئ ربط الأنشطة. شرح تفاصيل للإجراءات التقنية التي تم استخدامها خطوة بخطوة في هذه المخطوطة.
Introduction
جتباسيس رو هي مجموعة من البروتينات الصغيرة (21-25 كاتشين)، التي هي المصانة جيدا في جميع أنحاء تطور، وتشكل من فصيلة فريدة من نوعها في فوق رأس عائلة من جتباسيس الصغيرة. في كل فصيلة داخل هذا فوق عائلة، هناك مجال ز مشتركة أساسية التي تشارك في نشاط GTPase و تبادل النوكليوتيدات1. الفرق بين الأسرة رو وسوبفاميليس رأس الأخرى هو وجود “مجال إدراج رو” داخل حبلا βال 5 وفيال 4 α الحلزون في المجال GTPase صغيرة2.
استناداً إلى التصنيف الأخير، تعتبر “جتباسيس رو” عائلة من إشارات البروتينات التي تناسب فوق عائلة جتباسي رأس3. وقد الثدييات “رو جتباسيس” 22 عضوا على أساس وظيفة معينة والتوصيف العام4 الذي روا و Rac1، و Cdc42 من بين دراسة معظم أعضاء في هذه المجموعة. جتباسيس رو ترتبط بداخل الخلايا مما يشير إلى الممرات عبر إليه محكم تنظيم الذي يعتمد على رموز تبديل الجزيئية عن طريق البروتين التعديلات بوستترانسلاشونال5.
أنشئ تحميل والتحلل المائي الآليات الأساسية في دورة تنشيط/إلغاء تنشيط الصغيرة “رو جتباسيس” وهي تنظم عن طريق جتباسي-تفعيل البروتينات (الثغرات). هي المسؤولة عن التحلل المائي أنشئ الفجوات والعمل يدا واحدة مع جوانين النوكليوتيدات تبادل العوامل (جيفس) هي المسؤولة عن رد الفعل أنشئ في التحميل. الناتج المحلي الإجمالي رو تفارق مثبطات (جديس) تقديم المزيد من تنظيم “جتباسيس رو” الصغيرة عن طريق الربط إلى “جتباسيس رو” ربط الناتج المحلي الإجمالي. وهذا يحول دون الانفصال من الناتج المحلي الإجمالي، ويسهل عزل من “جتباسيس رو” الصغيرة بعيداً عن المواقع غشاء داخل الخلية النشطة. كما يوجد كذلك تنظيم البروتينات GTPase رو التي تنطوي برينيليشن جديس الذي ينظم كل من النوكليوتيدات التحلل المائي والصرف وعناصر الناتج المحلي الإجمالي/غتب ركوب الدراجات1،6،،من78.
أنشئ في التحميل وبرينيليشن “جتباسي رو” تشارك في حركة “جتباسي رو” بين سيتوسول وأغشية الخلايا عن طريق تغيير الخصائص الفيزيائية لهذه البروتينات1،9. الجهات التنظيمية المذكورة أعلاه التفاعل مع فوسفوليبيدات غشاء الخلية والبروتينات الأخرى تحوير ل نشاط تبادل غتب/الناتج المحلي الإجمالي10. وعلاوة على ذلك، كتلة جديس، مثبطات الانفصال، أنشئ التحلل المائي وتبادل غتب/الناتج المحلي الإجمالي. جديس تحول دون تفكك البروتينات رو غير النشطة من الناتج المحلي الإجمالي، ومن ثم تفاعلها مع المستجيبة المتلقين للمعلومات. كما تنظم جديس ركوب الدراجات من جتباسيس بين سيتوسول وغشاء في الخلية. نشاط “جتباسيس رو” يعتمد إلى حد كبير على حركتهم لغشاء الخلية؛ وهكذا، تعتبر جديس المنظمين الحرجة التي يمكن عزل جتباسيس في السيتوبلازم عن طريق الاختباء بها11،مسعور المنطقة/المجالات12.
ل GTPase رو أن يكون إشارات والدالة الأمثل في جميع مراحل دورة التنشيط، دورة الحيوي التحلل غتب-تحميل/غتب أمر حاسم. قد يؤدي إجراء تغييرات لاحقة في وظائف الخلية وينظم GTPase رو، مثل خلية قطبية، انتشار، morphogenesis، سيتوكينيسيس، والهجرة والالتصاق والبقاء على قيد الحياة13،14أي نوع من التعديلات في هذه العملية.
وينص البروتوكول الحالي القراء بطريقة مفصلة لرصد صغيرة GTPase روا التنشيط عن طريق التحقيق في برينيليشن، والناتج المحلي الإجمالي/غتب تحميل. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب للكشف عن برينيليشن وربط أنشئ مجموعة واسعة من جتباسيس الصغيرة. يمكن استخدام مقايسة الممتز مرتبطة جتباسي لقياس مستوى التنشيط لأنواع أخرى من جتباسيس، مثل Rac1، Rac2، Rac3، ح أو ك، أو رأس ن، والمنتدى الإقليمي للاسيان، ورو15. ويستخدم سيمفاستاتين وكيل الدوائية كمثال على ذلك، كما ذكر مؤخرا أن تشارك في تنظيم صغير “رو جتباسي” برينيليشن والنشاط8،9،،من1416.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا يصف لنا طريقة دقيقة لقياس صغيرة جتباسي برينيليشن وأنشئ ملزمة كما هو موضح الصغيرة جتباسي سوبسيلولار التعريب (غشاء مقابل سيتوسول) و “أنشئ رو” تحميل. جتباسيس الصغيرة التي أعرب عنها في الخلايا حقيقية النواة، وتلعب دوراً أساسيا في انتشار الهاتف الخلوي، وحركية، وهيكل. برينيليشن وربط غت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد غافامي سعيد “الصحة العلوم مركز التشغيل منحة”، كريم العاملة بمنحه و “البحوث مانيتوبا المحقق الجديد يعمل بمنحه”. وأيد على زاده جواد سنهم مانيتوبا البحوث. شجاعي شهلا تدعمها منحة “تعمل مؤسسة العلوم الصحية” و “تسريع ميتكس” زمالة ما بعد الدكتوراه. وأيد عادل رضائي موغادام الأموال العاملة المنح التي عقدت قبل جوزيف جورج غوردون. وأيد أمير أ زكي على جائزة K08 المعاهد الوطنية للصحة/NHLBI (1K08HL114882-01A1). ماريك جيه لوس يرجى تعترف بالدعم من منحة نكن #2016/21/ب/NZ1/02812، تدعمها LE ستوديوم معهد الدراسات المتقدمة (منطقة المركز-فال دو لوار، فرنسا) من خلال “برنامج العام وادي اللوار الذكية” ويشترك في تمويله ماري إجراءات سكلودوفسكا كوري، منح #665790. وأيد أومجف سنهم سيموني دا روسا سيلفا.
Materials
| DMEM high Glucose | VWR (Canada) | VWRL0101-0500 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR (Canada) | CA45001-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR (Canada) | 97062-806 | |
| EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CA71007-118 | |
| EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CAAAJ60767-AE | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | VWR (Canada) | CA97061-340 | |
| Ammonium Persulfate | VWR (Canada) | CABDH9214-500G | |
| Tris-Hydroxymethylaminomethane | VWR (Canada) | CA71009-186 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Biorad (Canada) | 1610158 | |
| TEMED | Biorad (Canada) | 1610801 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma/Aldrich (Canada) | P8340-5ML | 1:75 dilution |
| Rho-GTPase Antibody Sampler Kit | Cell Signaling (Canada) | 9968 | 1:1000 dilution |
| Pan-Cadherin antibody | Cell Signaling (Canada) | 4068 | 1:1000 dilution |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology (USA) | sc-69778 | 1:3000 dilution |
| RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format) | Cytoskeleton Inc. (USA) | BK121 | Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016. |
| RhoA Antibody | Cell Signaling | 2117 | |
| ECL | Amersham-Pharmacia Biotech | RPN2209 | |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibody | Sigma | A6154-1ML | |
| SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | 1612071A | Spectrophotometer |
| Nonidet P-40 | Sigma | 11332473001 | non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol |
| DMSO | Sigma | D8418-50ML | |
| PBS | Sigma | P5493-1L | |
| Phophatase Inhibitor cocktail | Sigma | P5726-5ML | 1:75 Dilution |
References
- Yeganeh, B., et al. Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease, cancer and pulmonary disease. Pharmacology & Therapeutics. 143 (1), 87-110 (2014).
- Valencia, A., Chardin, P., Wittinghofer, A., Sander, C. The ras protein family: evolutionary tree and role of conserved amino acids. Biochemistry. 30 (19), 4637-4648 (1991).
- Hall, A. Rho family GTPases. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1378-1382 (2012).
- Rojas, A. M., Fuentes, G., Rausell, A., Valencia, A. The Ras protein superfamily: evolutionary tree and role of conserved amino acids. The Journal of Cell Biology. 196 (2), 189-201 (2012).
- Cherfils, J., Zeghouf, M. Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs. Physiological Reviews. 93 (1), 269-309 (2013).
- Shojaei, S., et al. Perillyl Alcohol (Monoterpene Alcohol), Limonene. Enzymes. 36, 7-32 (2014).
- Ghavami, S., et al. Airway mesenchymal cell death by mevalonate cascade inhibition: integration of autophagy, unfolded protein response and apoptosis focusing on Bcl2 family proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (7), 1259-1271 (2014).
- Alizadeh, J., et al. Mevalonate Cascade Inhibition by Simvastatin Induces the Intrinsic Apoptosis Pathway via Depletion of Isoprenoids in Tumor Cells. Scientific Reports. 7, 44841 (2017).
- Ghavami, S., et al. Mevalonate cascade regulation of airway mesenchymal cell autophagy and apoptosis: a dual role for p53. PLoS One. 6 (1), e16523 (2011).
- Tang, Y., Olufemi, L., Wang, M. T., Nie, D. Role of Rho GTPases in breast cancer. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 759-776 (2008).
- DerMardirossian, C., Bokoch, G. M. GDIs: central regulatory molecules in Rho GTPase activation. Trends in Cell Biology. 15 (7), 356-363 (2005).
- Garcia-Mata, R., Boulter, E., Burridge, K. The ‘invisible hand’: regulation of RHO GTPases by RHOGDIs. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 493-504 (2011).
- Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
- Ghavami, S., et al. Geranylgeranyl transferase 1 modulates autophagy and apoptosis in human airway smooth muscle. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L420-L428 (2012).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-535 (2000).
- Ghavami, S., et al. Statin-triggered cell death in primary human lung mesenchymal cells involves p53-PUMA and release of Smac and Omi but not cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta. 1803 (4), 452-467 (2010).
- Cordle, A., Koenigsknecht-Talboo, J., Wilkinson, B., Limpert, A., Landreth, G. Mechanisms of statin-mediated inhibition of small G-protein function. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34202-34209 (2005).
- Waiczies, S., Bendix, I., Zipp, F. Geranylgeranylation but not GTP-loading of Rho GTPases determines T cell function. Science Signaling. 1 (12), pt3 (2008).
- Waiczies, S., et al. Geranylgeranylation but not GTP loading determines rho migratory function in T cells. Journal of Immunology. 179 (9), 6024-6032 (2007).
- Satori, C. P., Kostal, V., Arriaga, E. A. Review on Recent Advances in the Analysis of Isolated Organelles. Analytica Chimica Acta. 753, 8-18 (2012).
- Berndt, N., Sebti, S. M. Measurement of protein farnesylation and geranylgeranylation in vitro, in cultured cells and in biopsies, and the effects of prenyl transferase inhibitors. Nature Protocols. 6 (11), 1775-1791 (2011).
- Keely, P. J., Conklin, M. W., Gehler, S., Ponik, S. M., Provenzano, P. P. Investigating integrin regulation and signaling events in three-dimensional systems. Methods in Enzymology. 426, 27-45 (2007).
- Oliver, A. W., et al. The HPV16 E6 binding protein Tip-1 interacts with ARHGEF16, which activates Cdc42. British Journal of Cancer. 104 (2), 324-331 (2011).
- Moniz, S., Matos, P., Jordan, P. WNK2 modulates MEK1 activity through the Rho GTPase pathway. Cellular Signalling. 20 (10), 1762-1768 (2008).
