Détection des petits GTPase prénylation et GTP Binding utilisant le fractionnement Membrane et GTPase-linked Immunosorbent Assay
Summary
Nous décrivons ici un protocole afin d’étudier la prénylation et la guanosine-5′-triphosphate (GTP)-chargement de la Rho GTPase. Ce protocole comprend deux méthodes détaillées, à savoir fractionnement membrane et une GTPase-immuno assay. Le protocole peut être utilisé pour mesurer la prénylation et la GTP chargement de différentes autres petites GTPases.
Abstract
La famille Rho GTPase appartient à la superfamille des Ras et comprend environ 20 membres chez les humains. GTPases Rho sont importants dans la régulation des différentes fonctions cellulaires, y compris la dynamique du cytosquelette, motilité cellulaire, polarité cellulaire, guidage axonal, trafic vésiculaire et contrôle du cycle cellulaire. Changements dans la signalisation de la Rho GTPase jouent un rôle réglementaire essentiel dans nombreuses pathologies, comme le cancer, les maladies du système nerveux central et dépendant du système immunitaire maladies. La modification post-traductionnelle des GTPases Rho (c.-à-d., prénylation de mévalonate voie intermédiaires) et liant GTP sont des facteurs clés qui influent sur l’activation de cette protéine. Dans le présent document, deux méthodes simples et essentiels sont fournis pour détecter une large gamme de Rho GTPase prénylation et activités de fixation de GTP. Détails des procédures techniques qui ont été utilisées sont expliquées étape par étape dans ce manuscrit.
Introduction
GTPases Rho sont un groupe de petites protéines (21-25 kDa), qui sont bien conservée tout au long de l’évolution et forment une sous-famille unique dans la superfamille de Ras des petites GTPases. Dans chaque sous-famille au sein de cette superfamille, il y a un noyau de domaine G partagé qui est impliqué dans l’activité GTPase et nucléotides échange1. La différence entre la famille Rho et autres sous-familles Ras est la présence d’un « domaine d’insert Rho » dans le brin β 5ème et le 4ème α hélice dans le petit du domaine GTPase2.
D’après la classification récente, Rho GTPases sont considérés comme une famille de protéines qui entrent dans la superfamille de Ras GTPase3de signalisation. Chez les mammifères GTPases Rho ont 22 membres selon leur fonction spécifique et caractérisation générale4 dans lequel RhoA, Rac1 et Cdc42 comptent parmi les membres plus-étudiées dans ce groupe. GTPases Rho sont liés à intracellulaire signalisation voies via un mécanisme étroitement réglementé, qui dépend de commutateurs moléculaires via la protéine des modifications post-traductionnelles5.
Chargement de GTP et l’hydrolyse sont des mécanismes essentiels dans le cycle d’activation/désactivation des petites GTPases Rho et sont réglementées par l’intermédiaire des protéines GTPase-activating (lacunes). Les lacunes sont responsables de l’hydrolyse du GTP et travaillent de concert avec la guanine nucleotide exchange des facteurs (elle) qui sont responsables de la réaction de GTP-chargement. Inhibiteurs de la dissociation du PIB Rho (GDIs) fournissent réglementation des petites GTPases Rho via la liaison pour le PIB lié aux Rho GTPases. Cela inhibe la dissociation du PIB et facilite la séquestration des petites GTPases Rho loin des sites de la membrane intracellulaire active. Il y a aussi plus régulation des protéines Rho GTPase impliquant la prénylation des GDIs qui réglemente l’hydrolyse des nucléotides et exchange et contrôles GDP/GTP cyclisme1,6,7,8.
GTP-chargement tant Rho GTPase prénylation sont impliqués dans le mouvement de la Rho GTPase entre le cytosol et les membranes cellulaires en modifiant les propriétés lipophiles de ces protéines1,9. Les organismes de réglementation susmentionnée interagissent avec les phospholipides de la membrane cellulaire et d’autres protéines de modulation de l’activité/échange GDP/GTP10. En outre, GDIs, inhibiteurs de la dissociation, bloquent l’hydrolyse du GTP tant l’échange GDP/GTP. GDIs inhibent la dissociation des protéines Rho inactifs du PIB et, par conséquent, leur interaction avec les effecteurs en aval. GDIs réglementent aussi le cycle des GTPases entre le cytosol et la membrane de la cellule. L’activité des GTPases Rho dépend dans une large mesure leur mouvement vers la membrane cellulaire ; ainsi, GDIs sont considérés comme des régulateurs critiques qui peuvent séquestrer GTPases dans le cytoplasme grâce à cacher leur région hydrophobe/domaines11,12.
Pour Rho GTPase d’avoir une signalisation optimale et la fonction à tous les stades de son cycle d’activation, le cycle dynamique de l’hydrolyse du GTP-chargement/GTP est crucial. Tout type d’altérations dans ce processus peut entraîner des changements subséquents dans les fonctions cellulaires relevant de la Rho GTPase, comme cellule polarité, prolifération, morphogenèse, cytocinèse, migration, adhérence et la survie de13,14.
Le protocole actuel fournit aux lecteurs une méthode détaillée pour surveiller les petits RhoA GTPase activation via l’enquête leur prénylation et GDP/GTP chargement. Cette méthode peut également être utilisée pour détecter la prénylation et la liaison de GTP d’un large éventail de petites GTPases. La GTPase immuno-peut être utilisé pour mesurer le niveau de l’activation d’autres sortes de GTPases, tels que Rac1 Rac2, Rac3, H-, K- et N-Ras, Arf et Rho15. La simvastatine agent pharmacologique est utilisé à titre d’exemple, comme il a été récemment signalé à être impliqué dans la régulation des petits Rho GTPase prénylation et activité8,9,14,,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici une méthode précise pour mesurer la petite GTPase prénylation et liant GTP affichée sous la petite GTPase localisation subcellulaire (membrane versus cytosol) et Rho GTP chargement. Petites GTPases sont exprimés dans les cellules eucaryotes et jouent un rôle essentiel dans la prolifération cellulaire, la motilité et la structure. Tant prénylation et liant GTP sont impliqués dans la régulation de l’activité GTPase ; par conséquent, des épreuves pour évaluer la prénylation et…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Saeid Ghavami a été financée par une subvention de fonctionnement de Centre de sciences de santé, CHRIM et recherche Manitoba Nouveau chercheur d’exploitation subvention de fonctionnement. Javad Alizadeh était accompagnée d’une bourse de recherche du Manitoba. Shahla Shojaei était soutenu par une subvention de fonctionnement de santé Science Foundation et la bourse postdoctorale MITACS accélération. Adel Rezaei Moghadam a appuyé un CRSNG Subv qui s’est tenue par Joseph W. Gordon. Amir A. Zeki a été appuyée par le NIH/NHLBI K08 award (1K08HL114882-01 a 1). Marek J. Los gentiment reconnaît l’appui de NCN accorder #2016/21/B/NZ1/02812, soutenu par LE STUDIUM Institute for Advanced Studies (région Centre-Val de Loire, France) par le biais de son programme général de Smart Loire Valley et cofinancé par la Marie Actions de Sklodowska-Curie, accorder #665790. Simone da Silva Rosa était accompagnée d’une bourse d’étude UMGF.
Materials
| DMEM high Glucose | VWR (Canada) | VWRL0101-0500 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR (Canada) | CA45001-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR (Canada) | 97062-806 | |
| EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CA71007-118 | |
| EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CAAAJ60767-AE | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | VWR (Canada) | CA97061-340 | |
| Ammonium Persulfate | VWR (Canada) | CABDH9214-500G | |
| Tris-Hydroxymethylaminomethane | VWR (Canada) | CA71009-186 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Biorad (Canada) | 1610158 | |
| TEMED | Biorad (Canada) | 1610801 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma/Aldrich (Canada) | P8340-5ML | 1:75 dilution |
| Rho-GTPase Antibody Sampler Kit | Cell Signaling (Canada) | 9968 | 1:1000 dilution |
| Pan-Cadherin antibody | Cell Signaling (Canada) | 4068 | 1:1000 dilution |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology (USA) | sc-69778 | 1:3000 dilution |
| RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format) | Cytoskeleton Inc. (USA) | BK121 | Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016. |
| RhoA Antibody | Cell Signaling | 2117 | |
| ECL | Amersham-Pharmacia Biotech | RPN2209 | |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibody | Sigma | A6154-1ML | |
| SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | 1612071A | Spectrophotometer |
| Nonidet P-40 | Sigma | 11332473001 | non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol |
| DMSO | Sigma | D8418-50ML | |
| PBS | Sigma | P5493-1L | |
| Phophatase Inhibitor cocktail | Sigma | P5726-5ML | 1:75 Dilution |
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