Deteção de pequena GTPase Prenilação e GTP ligação usando o fracionamento de membrana e ensaio de imunoabsorção ligada de GTPase
Summary
Aqui descrevemos um protocolo para investigar a Prenilação e guanosina-5′-trifosfato (GTP)-carregamento de GTPase. Esse protocolo consiste em dois métodos detalhados, nomeadamente o fracionamento de membrana e uma GTPase-lig da imunoabsorção do ensaio. O protocolo pode ser utilizado para medir a Prenilação e GTP carregamento de diferentes outras GTPases pequenas.
Abstract
A família de GTPase pertence à superfamília de Ras e inclui aproximadamente 20 membros em seres humanos. As GTPases Rho são importantes na regulação das diversas funções celulares, incluindo a dinâmica do citoesqueleto, motilidade celular, polaridade da célula, orientação axonal, tráfico vesicular e controlo do ciclo celular. Mudanças na sinalização de GTPase desempenham um papel essencial de regulamentar em muitas condições patológicas, tais como câncer, doenças do sistema nervoso central e doenças do sistema imunológico-dependente. A modificação pós-traducional de vinculação de GTP e GTPases Rho (ou seja, Prenilação por intermediários de via do mevalonato) são fatores-chave que afetam a ativação desta proteína. Neste trabalho, dois métodos simples e essenciais são fornecidos para detectar uma gama ampla de GTPase Prenilação e atividades de vinculação de GTP. Detalhes dos procedimentos técnicos que têm sido utilizados são explicadas passo a passo neste manuscrito.
Introduction
As GTPases Rho são um grupo de pequenas proteínas (21-25 kDa), que são bem conservadas ao longo da evolução e formar uma única subfamília na superfamília de Ras de pequenas GTPases. Cada subfamília dentro desta superfamília, há um núcleo de domínio compartilhado G que está envolvido na atividade GTPase e nucleotídeos troca1. A diferença entre a família Rho e as outras subfamílias de Ras é a presença de um “domínio de inserção de Rho” dentro da vertente β 5th eth 4 hélice α no pequeno domínio GTPase2.
Com base na classificação recente, as GTPases Rho são consideradas uma família de proteínas que se encaixam a superfamília de Ras GTPase3de sinalização. Mamíferos GTPases Rho tem 22 membros com base em sua função específica e caracterização geral4 em que RhoA, Rac1 e Cdc42 estão entre os membros mais estudado neste grupo. As GTPases Rho estão ligadas intracelular sinalização percursos através de um mecanismo rigidamente regulamentado, que é dependente de interruptores molecular através de modificações do posttranslational proteína5.
GTP carregando hidrólise mecanismos essenciais no ciclo de ativação/desativação de pequenas GTPases Rho e são regulamentados através de proteínas GTPase-ativando (lacunas). As lacunas são responsáveis para a hidrólise de GTP e trabalham em conjunto com guanina nucleotídeo troca fatores (GEFs) que são responsáveis para a reação de GTP-carregamento. Inibidores de dissociação de Rho PIB (GDIs) fornecem mais regulamento de pequenas GTPases Rho através de ligação para o PIB-limite Rho GTPases. Isto inibe a dissociação do PIB e facilita o sequestro de pequenas GTPases Rho longe de sites a membrana intracelular ativa. Há também mais Regulamento das proteínas de GTPase envolvendo a Prenilação de GDIs que regula tanto a hidrólise de nucleotídeos e troca e controles PIB/GTP ciclismo1,6,7,8.
Tanto GTP-carregamento Prenilação de GTPase são envolvidos no movimento de GTPase entre citosol e membranas celulares, alterando as propriedades lipofílicas destas proteínas1,9. Os reguladores acima referido interagirem com fosfolipídios da membrana celular e outras proteínas modulação do PIB/GTP troca atividade10. Além disso, GDIs, inibidores de dissociação, bloqueiam tanto a hidrólise de GTP e a troca GDP/GTP. GDIs inibir a dissociação das proteínas Rho inativas do PIB e, portanto, sua interação com a jusante efetores. GDIs também regular o ciclismo de GTPases entre o citosol e a membrana na célula. A atividade de GTPases Rho depende em grande medida seu movimento para a membrana da célula; assim, GDIs são considerados como reguladores críticos que podem sequestrar as GTPases no citoplasma através de esconder sua região hidrofóbica/domínios11,12.
Para ter uma ótima sinalização e função em todas as fases do seu ciclo de ativação de GTPase, o ciclo dinâmico da hidrólise de GTP-carregamento/GTP é crucial. Qualquer tipo de alterações neste processo pode resultar em alterações subsequentes na célula funções regulamentadas de GTPase, tais como célula polaridade, proliferação, morfogênese, citocinese, migração, adesão e sobrevivência13,14.
O protocolo atual oferece aos leitores com um método detalhado para monitorar pequeno RhoA GTPase ativação através de investigação de suas Prenilação e PIB/GTP de carregamento. Esse método também pode ser usado para detectar a Prenilação e vinculação de GTP de uma vasta gama de pequenas GTPases. A GTPase de imunoabsorção pode ser usada para medir o nível de ativação de outros tipos de GTPases, tais como Rac1, Rac2, RAP3, H, K ou N-Ras, Arf e Rho15. A agente farmacológico sinvastatina é usada como um exemplo, como recentemente foi relatado para ser envolvido na regulação do pequeno de GTPase Prenilação e atividade8,9,14,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui nós descrevemos um método exato para medir pequena GTPase Prenilação e vinculação de GTP mostrado como pequena GTPase Localização subcellular (membrana contra citosol) e Rho GTP carregando. As GTPases pequenas são expressos em células eucarióticas e desempenham um papel essencial na proliferação celular, mobilidade e estrutura. Ambos Prenilação e vinculação de GTP estão envolvidos na regulação da atividade GTPase; Portanto, os ensaios para avaliar a Prenilação e vinculação de GTP des…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Saeid Ghavami foi apoiado por uma saúde ciência centro operacional Grant, CHRIM funcionamento grant e Manitoba novo investigador operando bolsa de investigação. Javad Alizadeh foi apoiado pela bolsa de estudo de pesquisa de Manitoba. Shahla Shojaei foi apoiado por uma subvenção de funcionamento de fundação de ciência saúde e a sociedade pós-doutorada MITACS acelerar. Adel Rezaei Moghadam foi apoiado por um NSERC operacional de concessão que foi realizada por Joseph W. Gordon. Amir r. Zeki foi apoiado pelo prêmio NIH/NHLBI K08 (1K08HL114882-01A1). Marek J. Los gentilmente reconhece o apoio do NCN conceder #2016/21/B/NZ1/02812, apoiado por LE STUDIUM Instituto de estudos avançados (região centro-Val de Loire, França) através do seu programa geral de vale de Loire esperto e co-financiado pela Marie Acções de Sklodowska-Curie, grant #665790. Simone da Silva Rosa foi apoiada pela bolsa de estudo UMGF.
Materials
| DMEM high Glucose | VWR (Canada) | VWRL0101-0500 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR (Canada) | CA45001-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR (Canada) | 97062-806 | |
| EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CA71007-118 | |
| EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CAAAJ60767-AE | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | VWR (Canada) | CA97061-340 | |
| Ammonium Persulfate | VWR (Canada) | CABDH9214-500G | |
| Tris-Hydroxymethylaminomethane | VWR (Canada) | CA71009-186 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Biorad (Canada) | 1610158 | |
| TEMED | Biorad (Canada) | 1610801 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma/Aldrich (Canada) | P8340-5ML | 1:75 dilution |
| Rho-GTPase Antibody Sampler Kit | Cell Signaling (Canada) | 9968 | 1:1000 dilution |
| Pan-Cadherin antibody | Cell Signaling (Canada) | 4068 | 1:1000 dilution |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology (USA) | sc-69778 | 1:3000 dilution |
| RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format) | Cytoskeleton Inc. (USA) | BK121 | Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016. |
| RhoA Antibody | Cell Signaling | 2117 | |
| ECL | Amersham-Pharmacia Biotech | RPN2209 | |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibody | Sigma | A6154-1ML | |
| SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | 1612071A | Spectrophotometer |
| Nonidet P-40 | Sigma | 11332473001 | non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol |
| DMSO | Sigma | D8418-50ML | |
| PBS | Sigma | P5493-1L | |
| Phophatase Inhibitor cocktail | Sigma | P5726-5ML | 1:75 Dilution |
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