Küçük GTPazlar prenilasyon ve bağlayıcı kullanarak membran ayırma ve GTPazlar bağlı Immunosorbent Assay GTP tespiti
Summary
Burada tarif biz prenilasyon ve guanozin-5′-trifosfat (GTP) araştırmak için bir protokol-Rho GTPazlar yükleme. Bu protokol iki detaylı yöntemi oluşur, yani membran ayırma ve GTPazlar bağlı immunosorbent assay. Protokolü prenilasyon ve GTP ölçmek için kullanılabilir diğer küçük GTPases’den başka bir yükleme.
Abstract
Rho GTPazlar aile Ras süper ait olan ve yaklaşık 20 üyesi insanlarda içeren. Rho GTPases hücre iskeleti dynamics, hücre hareketliliği, hücre polarite, aksonlar rehberlik, veziküler kaçakçılığı ve hücre döngüsünün kontrolü de dahil olmak üzere çeşitli hücresel fonksiyonları Yönetmelikte önemlidir. Rho GTPazlar sinyal değişiklikleri birçok patolojik koşulları, kanser, merkezi sinir sistemi hastalıkları ve bağışıklık sistemine bağlı hastalıklar gibi önemli bir düzenleyici rol oynamaktadır. Rho GTPases (yani, prenilasyon mevalonate yolu intermediates tarafından) ve GTP bağlama ardından değişiklik bu proteinin aktivasyonu etkileyen önemli faktörler vardır. Bu yazıda, Rho GTPazlar geniş aralığı prenilasyon ve GTP bağlama faaliyetleri tespit etmek için iki temel ve basit yöntem sağlanır. Kullanılmış olan teknik prosedürler ayrıntılarını açıklanmıştır adım adım bu el yazması.
Introduction
Rho GTPases de evrim korunmuş ve küçük GTPases Ras süper benzersiz bir alt form küçük proteinler (21-25 kDa), bir grubuz. Bu üst aile içinde her alt familya içinde GTPazlar etkinlik ve nükleotid exchange1söz konusu paylaşılan bir G etki alanı çekirdek vardır. Bir “Rho Ekle etki” 5inci β iplikçik ve küçük GTPazlar etki alanı24th α helix içindeki varlığı Rho aile ve diğer Ras alt familyaya arasındaki farktır.
Son sınıflandırmaya göre dayanarak, Rho GTPases Ras GTPazlar süper3içine sığacak proteinler sinyal bir aile olarak kabul edilir. Memeli Rho GTPases özel bir fonksiyonu ve RhoA, Rac1 ve Cdc42 bu grubun en okudu üyeleri arasında olan genel karakterizasyonu4 bağlı 22 üye var. Rho GTPases hücre içi sinyal yolları üzerinden için moleküler anahtarları ile protein ardından değişiklikler5üzerinde bağımlı olan sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir mekanizma bağlanır.
Yükleme GTP ve hidroliz temel mekanizmaları küçük Rho GTPases etkinleştirme/devre dışı bırakılması döngüsünde olan ve düzenlenmiş üzerinden GTPazlar aktive protein (boşluk). Boşluklar GTP hidroliz için sorumlu ve GTP-yükleme tepki için sorumlu olan guanin nükleotid Satım faktörler (GEFs) ile uyum içinde çalışmak. Rho GSYİH ayrılma inhibitörleri (GDIs) daha fazla GSYİH bağlı Rho GTPases için düzenleme, küçük Rho GTPases üzerinden bağlama sağlamak. Bu GSYİH ayrılma engeller ve küçük Rho GTPases etkin hücre içi membran siteleri uzak, iyon kolaylaştırır. Ayrıca daha fazla Rho GTPazlar proteinlerin nükleotit hidroliz ve değişimi ve denetimleri GSYİH/GTP1,6,7,8Bisiklete binme düzenleyen prenilasyon GDIs, ilgili yönetmelik olduğunu.
GTP-yükleme ve Rho GTPazlar prenilasyon Rho GTPazlar hareketi sitozol ve hücre zarlarında arasında bu proteinler1,9lipofilik özelliklerini değiştirerek söz konusu. Yukarıda belirtilen düzenleyiciler hücre membran fosfolipitler ve GSYİH/GTP Satım aktivite10modülasyonlu diğer proteinler ile etkileşim. Ayrıca, GDIs, ayrılma inhibitörleri, GTP hidroliz ve GSYİH/GTP değişimi engellemek. GDIs ayrılma GSYİH üzerinden etkin olmayan Rho proteinlerin ve bu nedenle, onların etkileşim ile aşağı akım effectors inhibe. GDIs da GTPases sitozol ve hücre membran arasında Bisiklete binme düzenler. Rho GTPases aktivite büyük ölçüde kendi hareketi hücre zarı için bağlıdır; Böylece, GDIs GTPases onların hidrofobik bölge/etki alanları11,12gizleme ile sitoplazma içinde çekilmek olabilir kritik düzenleyiciler olarak kabul edilmektedir.
Rho GTPazlar’ın bir optimum sinyal ve işlevi onun harekete geçirmek döngüsünün tüm aşamalarında olması gerekir GTP-yükleme/GTP hidroliz dinamik döngüsünü çok önemlidir. Değişiklikler bu süreçte her türlü hücre polarite, nükleer silahların yayılmasına karşı morfogenez, sitokinez, geçiş, yapışma ve hayatta kalma13,gibi14Rho GTPazlar tarafından düzenlenir hücre işlevlerinde değişiklikler neden olabilir.
Geçerli protokol okuyucuları onların prenilasyon ve GSYİH/GTP yükleme incelenmesi küçük RhoA GTPazlar harekete geçirmek yolu ile izlemek için detaylı bir yöntemle sağlar. Bu yöntem aynı zamanda prenilasyon ve küçük GTPases geniş bir GTP bağlama algılamak için kullanılabilir. GTPazlar bağlı immunosorbent assay harekete geçirmek-in GTPases, Rac1, Rac2, Rac3, H, K- veya N-Ras, Arf ve Rho15gibi diğer tür düzeyini ölçmek için kullanılabilir. Bu son zamanlarda küçük Rho GTPazlar prenilasyon etkinlik8,9,14,ve16Yönetmelikte dahil olmak bildirildi gibi farmakolojik Ajan simvastatin örnek olarak kullanılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada küçük GTPazlar prenilasyon ve küçük GTPazlar hücre altı yerelleştirme (membran karşı sitozol) ve Rho GTP yükleme gösterilen GTP bağlama ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Küçük GTPases ökaryotik hücrelerde ifade edilir ve hücre proliferasyonu, hareketliliği ve yapısı içinde önemli rol oynarlar. Prenilasyon ve GTP bağlama GTPazlar aktivite Yönetmelikte söz konusu; Bu nedenle, deneyleri prenilasyon ve GTP bağlama bu proteinlerin değerlendirmek için hücre biyologla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Saeid Ghavami sağlık bilim merkezi işletim Grant tarafından grant ve araştırma Manitoba yeni araştırmacı bursu işletim işletim CHRIM desteklenmiştir. Javad Alizade araştırma Manitoba öğrencilik tarafından desteklenmiştir. Şahla Shojaei bir sağlık Bilim Vakfı faaliyet hibe ve MITACS hızlandırmak doktora sonrası bursu tarafından desteklenmiştir. Adel Rezaei Moghadam Joseph W. Gordon tarafından düzenlenen hibe işletim bir NSERC tarafından desteklenmiştir. Amir A. Zeki NIH/NHLBI K08 Ödülü (1K08HL114882-01A1) tarafından desteklenmiştir. Marek J. Los nazikçe destekten NCN vermek #2016/21/B/NZ1/02812, onun akıllı Loire Valley Genel Program aracılığıyla Advanced Studies (bölge merkezi-Val de Loire, Fransa) LE STUDIUM Enstitüsü tarafından desteklenen ve eş Marie tarafından finanse eder Sklodowska-Curie eylemleri, #665790 verin. Simone da Silva Rosa UMGF öğrencilik tarafından desteklenmiştir.
Materials
| DMEM high Glucose | VWR (Canada) | VWRL0101-0500 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR (Canada) | CA45001-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR (Canada) | 97062-806 | |
| EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CA71007-118 | |
| EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CAAAJ60767-AE | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | VWR (Canada) | CA97061-340 | |
| Ammonium Persulfate | VWR (Canada) | CABDH9214-500G | |
| Tris-Hydroxymethylaminomethane | VWR (Canada) | CA71009-186 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Biorad (Canada) | 1610158 | |
| TEMED | Biorad (Canada) | 1610801 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma/Aldrich (Canada) | P8340-5ML | 1:75 dilution |
| Rho-GTPase Antibody Sampler Kit | Cell Signaling (Canada) | 9968 | 1:1000 dilution |
| Pan-Cadherin antibody | Cell Signaling (Canada) | 4068 | 1:1000 dilution |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology (USA) | sc-69778 | 1:3000 dilution |
| RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format) | Cytoskeleton Inc. (USA) | BK121 | Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016. |
| RhoA Antibody | Cell Signaling | 2117 | |
| ECL | Amersham-Pharmacia Biotech | RPN2209 | |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibody | Sigma | A6154-1ML | |
| SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | 1612071A | Spectrophotometer |
| Nonidet P-40 | Sigma | 11332473001 | non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol |
| DMSO | Sigma | D8418-50ML | |
| PBS | Sigma | P5493-1L | |
| Phophatase Inhibitor cocktail | Sigma | P5726-5ML | 1:75 Dilution |
References
- Yeganeh, B., et al. Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease, cancer and pulmonary disease. Pharmacology & Therapeutics. 143 (1), 87-110 (2014).
- Valencia, A., Chardin, P., Wittinghofer, A., Sander, C. The ras protein family: evolutionary tree and role of conserved amino acids. Biochemistry. 30 (19), 4637-4648 (1991).
- Hall, A. Rho family GTPases. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1378-1382 (2012).
- Rojas, A. M., Fuentes, G., Rausell, A., Valencia, A. The Ras protein superfamily: evolutionary tree and role of conserved amino acids. The Journal of Cell Biology. 196 (2), 189-201 (2012).
- Cherfils, J., Zeghouf, M. Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs. Physiological Reviews. 93 (1), 269-309 (2013).
- Shojaei, S., et al. Perillyl Alcohol (Monoterpene Alcohol), Limonene. Enzymes. 36, 7-32 (2014).
- Ghavami, S., et al. Airway mesenchymal cell death by mevalonate cascade inhibition: integration of autophagy, unfolded protein response and apoptosis focusing on Bcl2 family proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (7), 1259-1271 (2014).
- Alizadeh, J., et al. Mevalonate Cascade Inhibition by Simvastatin Induces the Intrinsic Apoptosis Pathway via Depletion of Isoprenoids in Tumor Cells. Scientific Reports. 7, 44841 (2017).
- Ghavami, S., et al. Mevalonate cascade regulation of airway mesenchymal cell autophagy and apoptosis: a dual role for p53. PLoS One. 6 (1), e16523 (2011).
- Tang, Y., Olufemi, L., Wang, M. T., Nie, D. Role of Rho GTPases in breast cancer. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 759-776 (2008).
- DerMardirossian, C., Bokoch, G. M. GDIs: central regulatory molecules in Rho GTPase activation. Trends in Cell Biology. 15 (7), 356-363 (2005).
- Garcia-Mata, R., Boulter, E., Burridge, K. The ‘invisible hand’: regulation of RHO GTPases by RHOGDIs. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 493-504 (2011).
- Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
- Ghavami, S., et al. Geranylgeranyl transferase 1 modulates autophagy and apoptosis in human airway smooth muscle. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L420-L428 (2012).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-535 (2000).
- Ghavami, S., et al. Statin-triggered cell death in primary human lung mesenchymal cells involves p53-PUMA and release of Smac and Omi but not cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta. 1803 (4), 452-467 (2010).
- Cordle, A., Koenigsknecht-Talboo, J., Wilkinson, B., Limpert, A., Landreth, G. Mechanisms of statin-mediated inhibition of small G-protein function. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34202-34209 (2005).
- Waiczies, S., Bendix, I., Zipp, F. Geranylgeranylation but not GTP-loading of Rho GTPases determines T cell function. Science Signaling. 1 (12), pt3 (2008).
- Waiczies, S., et al. Geranylgeranylation but not GTP loading determines rho migratory function in T cells. Journal of Immunology. 179 (9), 6024-6032 (2007).
- Satori, C. P., Kostal, V., Arriaga, E. A. Review on Recent Advances in the Analysis of Isolated Organelles. Analytica Chimica Acta. 753, 8-18 (2012).
- Berndt, N., Sebti, S. M. Measurement of protein farnesylation and geranylgeranylation in vitro, in cultured cells and in biopsies, and the effects of prenyl transferase inhibitors. Nature Protocols. 6 (11), 1775-1791 (2011).
- Keely, P. J., Conklin, M. W., Gehler, S., Ponik, S. M., Provenzano, P. P. Investigating integrin regulation and signaling events in three-dimensional systems. Methods in Enzymology. 426, 27-45 (2007).
- Oliver, A. W., et al. The HPV16 E6 binding protein Tip-1 interacts with ARHGEF16, which activates Cdc42. British Journal of Cancer. 104 (2), 324-331 (2011).
- Moniz, S., Matos, P., Jordan, P. WNK2 modulates MEK1 activity through the Rho GTPase pathway. Cellular Signalling. 20 (10), 1762-1768 (2008).
