Rilevazione di piccolo GTPase prenilazione e GTP Binding mediante frazionamento di membrana e GTPase-collegata dell'immunosorbente
Summary
Qui descriviamo un protocollo per studiare la prenilazione e guanosina-5′-trifosfato (GTP)-caricamento di Rho GTPasi. Questo protocollo è costituito da due metodi dettagliati, vale a dire del kit membrana frazionamento e un GTPase-collegata dell’immunosorbente. Il protocollo può essere utilizzato per misurare la prenilazione e GTP caricamento di diverse altre piccole GTPasi.
Abstract
La famiglia di Rho GTPasi appartiene alla superfamiglia Ras e comprende circa 20 membri in esseri umani. Rho GTPasi sono importanti nella regolazione di diverse funzioni cellulari, tra cui la dinamica del citoscheletro, motilità cellulare, polarità cellulare, guida assonale, traffico vescicolare e controllo del ciclo cellulare. Cambiamenti nella segnalazione di GTPasi Rho svolgono un ruolo normativo essenziale in molte condizioni patologiche, quali cancro, malattie del sistema nervoso centrale e malattie del sistema immunitario-dipendente. La modifica di posttranslational di Rho GTPasi (cioè, prenilazione di mevalonate pathway intermedi) e grippaggio di GTP sono fattori chiave che influenzano l’attivazione di questa proteina. In questa carta, sono disponibili due metodi semplici ed essenziali per rilevare una vasta gamma di Rho GTPasi prenilazione e attività obbligatorie di GTP. Dettagli delle procedure tecniche che sono state utilizzate sono spiegati passo dopo passo in questo manoscritto.
Introduction
Rho GTPasi sono un gruppo di piccole proteine (21-25 kDa), che sono ben conservate nel corso dell’evoluzione e formano un’unica sottofamiglia della superfamiglia Ras di piccolo GTPases. In ciascuna sottofamiglia all’interno di questa superfamiglia, c’è un nucleo di dominio condiviso di G che è coinvolto nella attività GTPasica e del nucleotide exchange1. La differenza tra la famiglia di Rho e le altre sottofamiglie di Ras è la presenza di un “dominio di inserto Rho” all’interno del filo del βth 5 e il 4th α elica in piccole GTPasi dominio2.
Secondo la classificazione recente, Rho GTPasi sono considerati una famiglia di proteine che si inseriscono nella superfamiglia Ras GTPase3di segnalazione. Mammiferi Rho GTPasi hanno 22 membri in base alla loro funzione specifica e caratterizzazione generale4 in cui RhoA, Rac1 e Cdc42 sono tra i membri più studiato in questo gruppo. Rho GTPasi sono collegati a intracellulare segnalazione vie tramite un meccanismo strettamente regolato che è dipendente da interruttori molecolari via proteina modifiche di posttranslational5.
GTP caricamento e idrolisi sono meccanismi essenziali nel ciclo di attivazione/disattivazione delle GTPasi Rho e sono regolamentati tramite proteine Gap (Gap). Le lacune sono responsabili dell’idrolisi del GTP e lavorano in concerto con fattori di scambio di nucleotide della guanina (GEF) che sono responsabili per la reazione di GTP-caricamento. Inibitori di Rho PIL dissociazione (GDIs) forniscono ulteriore regolamento di piccole GTPasi Rho via associazione per l’associazione a PIL Rho GTPasi. Questo inibisce la dissociazione di PIL e facilita sequestrante di Rho GTPasi dai siti intracellulari attiva della membrana. Ci è inoltre ulteriore regolamento delle proteine GTPasi Rho che coinvolgono la prenilazione di GDIs che regola sia idrolisi del nucleotide e cambio e controlli GDP/GTP ciclismo1,6,7,8.
GTP-caricamento sia Rho GTPasi prenilazione sono coinvolti nel movimento di Rho GTPasi tra citosol e membrane cellulari modificando le proprietà lipofiliche di queste proteine1,9. I regolatori di cui sopra interagiscono con i fosfolipidi della membrana cellulare e di altre proteine modulante dell’attività di scambio GDP/GTP10. Inoltre, GDIs, inibitori di dissociazione, bloccare sia l’idrolisi del GTP e lo scambio GDP/GTP. GDIs inibiscono la dissociazione delle proteine Rho inattive dal PIL e, pertanto, la loro interazione con effettori a valle. GDIs regolano anche il ciclismo delle GTPasi tra il citosol e membrana nella cella. L’attività di Rho GTPasi dipende in gran parte loro movimento alla membrana delle cellule; così, GDIs sono considerati come regolatori critici che possono sequestrare GTPasi nel citoplasma attraverso nascondendo loro regione/domini idrofobici11,12.
Per Rho GTPasi ad avere una segnalazione ottimale e la funzione in tutte le fasi del suo ciclo di attivazione, il ciclo dinamico di idrolisi del GTP-caricamento/GTP è cruciale. Qualsiasi tipo di alterazioni in questo processo può comportare modifiche successive di funzioni cellulari regolamentate da Rho GTPasi, come cellula polarità, proliferazione, morfogenesi, citochinesi, migrazione, adesione e la sopravvivenza di13,14.
L’attuale protocollo fornisce ai lettori con un metodo dettagliato monitoraggio piccolo RhoA GTPase attivazione tramite l’indagine sui loro prenilazione e GDP/GTP caricamento. Questo metodo può essere utilizzato anche per rilevare la prenilazione e grippaggio di GTP di una vasta gamma di piccole GTPasi. Il GTPase-collegata dell’immunosorbente può essere utilizzato per misurare il livello di attivazione di altri generi di GTPasi, come Rac1, Rac2, Rac3, H, K o N-Ras, Arf e Rho15. La simvastatina agente farmacologico è usato come un esempio, come recentemente è stato segnalato per essere coinvolti nella regolazione di piccole GTPasi Rho prenilazione e attività8,9,14,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo un metodo accurato per misurare piccole GTPasi prenilazione e mostrato come piccolo GTPase localizzazione subcellulare (membrana rispetto al cytosol) e Rho GTP caricamento del grippaggio di GTP. Piccole GTPasi sono espressi nelle cellule eucariotiche e svolgono un ruolo essenziale nella proliferazione cellulare, della motilità e della struttura. Sia prenilazione e grippaggio di GTP sono coinvolti nella regolazione dell’attività GTPasica; di conseguenza, le analisi per valutare la prenilazione e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Saeid Ghavami è stata sostenuta da una sovvenzione di funzionamento di salute scienza centro, CHRIM grant e ricerca Manitoba nuovo investigatore uso Grant di funzionamento. Javad Alizadeh è stato sostenuto da studentship ricerca Manitoba. Shahla Shojaei era sostenuto da un uso di salute scienza Foundation grant e la borsa di studio post-dottorato MITACS accelerare. Adel Rezaei Moghadam è stato sostenuto da una sovvenzione che era detenuto da Joseph W. Gordon di funzionamento di NSERC. Amir r. Zeki è stata sostenuta dal premio NIH/NHLBI K08 (1K08HL114882-01A1). Marek J. Los gentilmente riconosce il sostegno da NCN concedere #2016/21/B/NZ1/02812, supportato da LE STUDIUM Institute for Advanced Studies (regione centro-Val de Loire, Francia) attraverso il suo programma generale di Smart Loire Valley e co-finanziato dalla Marie Azioni di Sklodowska-Curie, concedere #665790. Simone da Silva Rosa è stato sostenuto da studentship UMGF.
Materials
| DMEM high Glucose | VWR (Canada) | VWRL0101-0500 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR (Canada) | CA45001-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR (Canada) | 97062-806 | |
| EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CA71007-118 | |
| EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CAAAJ60767-AE | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | VWR (Canada) | CA97061-340 | |
| Ammonium Persulfate | VWR (Canada) | CABDH9214-500G | |
| Tris-Hydroxymethylaminomethane | VWR (Canada) | CA71009-186 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Biorad (Canada) | 1610158 | |
| TEMED | Biorad (Canada) | 1610801 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma/Aldrich (Canada) | P8340-5ML | 1:75 dilution |
| Rho-GTPase Antibody Sampler Kit | Cell Signaling (Canada) | 9968 | 1:1000 dilution |
| Pan-Cadherin antibody | Cell Signaling (Canada) | 4068 | 1:1000 dilution |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology (USA) | sc-69778 | 1:3000 dilution |
| RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format) | Cytoskeleton Inc. (USA) | BK121 | Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016. |
| RhoA Antibody | Cell Signaling | 2117 | |
| ECL | Amersham-Pharmacia Biotech | RPN2209 | |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibody | Sigma | A6154-1ML | |
| SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | 1612071A | Spectrophotometer |
| Nonidet P-40 | Sigma | 11332473001 | non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol |
| DMSO | Sigma | D8418-50ML | |
| PBS | Sigma | P5493-1L | |
| Phophatase Inhibitor cocktail | Sigma | P5726-5ML | 1:75 Dilution |
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