Detectie van kleine GTPase Prenylation en GTP bindend gebruiken membraan fractionering en GTPase-linked Immunosorbent Assay
Summary
Hier beschrijven we een protocol voor het onderzoek naar de prenylation en 5′-Guanosinetrifosfaat (GTP)-laden van Rho GTPase. Dit protocol bestaat uit twee gedetailleerde methoden, namelijk membraan fractionering en een GTPase-linked immunosorbent assay. Het protocol kan worden gebruikt voor het meten van de prenylation en de GTP laden van verschillende andere kleine GTPases.
Abstract
De Rho GTPase familie behoort tot de superfamilie Ras en bestaat uit ongeveer 20 leden bij de mens. Rho GTPases zijn belangrijk bij de regulering van diverse cellulaire functies, met inbegrip van cytoskeletal dynamics, beweeglijkheid van de cel, cel polariteit, axonale begeleiding, vesiculaire handel en controle van de celcyclus. Wijzigingen in de signalering van Rho GTPase spelen een essentiële regulerende rol in vele pathologische voorwaarden, zoals kanker, ziekten van het centrale zenuwstelsel en immuunsysteem-afhankelijke ziekten. De posttranslationele wijziging van Rho GTPases (d.w.z., prenylation door mevalonate traject tussenproducten) en bindende GTP zijn belangrijke factoren die van invloed zijn op de activering van dit eiwit. In dit document vindt u twee essentiële en eenvoudige methoden om een breed scala van Rho GTPase prenylation en GTP bindende activiteiten te detecteren. Details van de technische procedures die zijn gebruikt zijn uitgelegd stap voor stap in dit manuscript.
Introduction
Rho GTPases zijn een groep van kleine eiwitten (21-25 kDa), die zijn goed bewaard in de gehele evolutie, en vormen een unieke onderfamilie in de Ras-superfamilie van kleine GTPases. In elke onderfamilie binnen deze superfamilie is er een gedeelde G domein kern dat bij de GTPase activiteit en nucleotide exchange1 betrokken is. Het verschil tussen de Rho-familie en de andere onderfamilies van de Ras is de aanwezigheid van een “Rho invoegen domein” binnen de 5th β strand en de 4th -α-helix in de kleine GTPase domein2.
Gebaseerd op de recente classificatie, Rho GTPases worden beschouwd als een familie van signalering eiwitten die in het Ras GTPase superfamilie3past. Zoogdieren Rho GTPases hebben 22 leden op basis van hun specifieke functie en de algemene karakterisering4 in die RhoA, Rac1 en Cdc42 tot de meest bestudeerde leden in deze groep behoren. Rho GTPases zijn gekoppeld aan intracellulaire signalering trajecten via een strak gereguleerde mechanisme dat afhankelijk van de moleculaire schakelaars via eiwit posttranslationele modificaties5 is.
GTP laden en hydrolyse zijn essentiële mechanismen in de cyclus van de activering/deactivering van kleine Rho GTPases en gereglementeerde via GTPase-activeren eiwitten (hiaten). Hiaten zijn verantwoordelijk voor de GTP hydrolyse en werken in concert met guanine nucleotide uitwisseling factoren (GEFs) die verantwoordelijk voor de reactie van de GTP-laden zijn. Rho BBP dissociatie remmers (GDIs) nadere regulering van kleine Rho GTPases via bindende aan de BBP-gebonden Rho GTPases. Dit remt BBP dissociatie en vergemakkelijkt het vastleggen van kleine Rho GTPases uit de buurt van de actieve intracellulaire membraan-sites. Er is ook meer regulering van Rho GTPase eiwitten waarbij de prenylation voor GDIs die regelt zowel nucleotide hydrolyse en uitwisseling en besturingselementen BBP/GTP fietsen1,6,7,8.
Zowel de GTP-laden en de Rho GTPase prenylation zijn betrokken bij het verkeer van Rho GTPase tussen cytosol en celmembranen door de lipofiele eigenschappen van deze eiwitten1,9te wijzigen. De bovengenoemde regelgevers interactie met fosfolipiden van de celmembraan en andere modulerende eiwitten van het BBP/GTP exchange activiteit10. Bovendien blokkeren GDIs, dissociatie-remmers, zowel de GTP hydrolyse en de uitwisseling van BBP/GTP. GDIs remmen de dissociatie van de inactieve Rho eiwitten van BBP en dus hun interactie met stroomafwaartse effectoren. GDIs regelen ook de fietsen van GTPases tussen het cytosol en membraan in de cel. De activiteit van Rho GTPases hangt voor een groot deel hun beweging om de celmembraan; Dus, GDIs worden beschouwd als kritische toezichthouders die GTPases in het cytoplasma sekwestreren kunnen via hun hydrofobe regio/domeinen11,12te verbergen.
Voor Rho GTPase in alle stadia van de cyclus van de activering een optimale signalering en functie hebben, is de dynamische cyclus van GTP-laden/GTP hydrolyse van cruciaal belang. Elke vorm van wijzigingen in dit proces kan leiden tot daaropvolgende wijzigingen in cel functies geregeld door Rho GTPase, zoals cel polariteit, proliferatie, voedselproductie, cytokinese, migratie, hechting en overleving13,14.
Het huidige protocol biedt lezers met een gedetailleerde methode om te controleren kleine RhoA GTPase activering via het onderzoek van hun prenylation en BBP/GTP laden. Deze methode kan ook worden gebruikt om de prenylation en de GTP binding van een breed scala van kleine GTPases te detecteren. De GTPase-linked immunosorbent analyse kan worden gebruikt voor het meten van het niveau van de activering van andere soorten GTPases, zoals Rac1, Rac2, Rac3, H-, K- of N-Ras, Arf en Rho15. De farmacologische agent simvastatine wordt gebruikt als een voorbeeld, zoals het werd onlangs gemeld te worden betrokken bij de regulering van de kleine Rho GTPase prenylation en activiteit8,9,14,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een nauwkeurige methode voor het meten van kleine GTPase prenylation en GTP bindende weergegeven als kleine GTPase subcellular localisatie (membraan versus cytosol) en Rho GTP laden. Kleine GTPases worden uitgedrukt in eukaryote cellen en spelen een essentiële rol in de cellulaire proliferatie, beweeglijkheid en structuur. Zowel prenylation als GTP bindend zijn betrokken bij de regulering van GTPase activiteit; Daarom zijn testen om te evalueren van de prenylation en de GTP binding van deze …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Saeid Ghavami werd gesteund door een Health Science Centrum operationele subsidie, CHRIM operationele subsidie en Manitoba nieuwe onderzoeker werkzaam onderzoeksbeurs. Javad Alizadeh werd ondersteund door onderzoek Manitoba studententijd. Shahla Shojaei werd gesteund door een subsidie van Health Science Foundation actief en de MITACS versnellen postdoctoral fellowship. Adel Rezaei Moghadam werd gesteund door een subsidie die werd gehouden door Joseph W. Gordon operationele NSERC. Amir A. Zeki werd gesteund door de NIH/NHLBI K08 award (1K08HL114882-01A1). Marek J. Los kandidatuur erkent de steun van Nereus Carpit NOCTEM verlenen #2016/21/B/NZ1/02812, ondersteund door LE STUDIUM Institute for Advanced Studies (regio Centre-Val de Loire, Frankrijk) door zijn slimme algemene programma van de Loire-vallei en medegefinancierd door de Marie Sklodowska-Curie-acties, verlenen #665790. Simone da Silva Rosa werd gesteund door UMGF studententijd.
Materials
| DMEM high Glucose | VWR (Canada) | VWRL0101-0500 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR (Canada) | CA45001-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR (Canada) | 97062-806 | |
| EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CA71007-118 | |
| EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CAAAJ60767-AE | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | VWR (Canada) | CA97061-340 | |
| Ammonium Persulfate | VWR (Canada) | CABDH9214-500G | |
| Tris-Hydroxymethylaminomethane | VWR (Canada) | CA71009-186 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Biorad (Canada) | 1610158 | |
| TEMED | Biorad (Canada) | 1610801 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma/Aldrich (Canada) | P8340-5ML | 1:75 dilution |
| Rho-GTPase Antibody Sampler Kit | Cell Signaling (Canada) | 9968 | 1:1000 dilution |
| Pan-Cadherin antibody | Cell Signaling (Canada) | 4068 | 1:1000 dilution |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology (USA) | sc-69778 | 1:3000 dilution |
| RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format) | Cytoskeleton Inc. (USA) | BK121 | Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016. |
| RhoA Antibody | Cell Signaling | 2117 | |
| ECL | Amersham-Pharmacia Biotech | RPN2209 | |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibody | Sigma | A6154-1ML | |
| SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | 1612071A | Spectrophotometer |
| Nonidet P-40 | Sigma | 11332473001 | non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol |
| DMSO | Sigma | D8418-50ML | |
| PBS | Sigma | P5493-1L | |
| Phophatase Inhibitor cocktail | Sigma | P5726-5ML | 1:75 Dilution |
References
- Yeganeh, B., et al. Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease, cancer and pulmonary disease. Pharmacology & Therapeutics. 143 (1), 87-110 (2014).
- Valencia, A., Chardin, P., Wittinghofer, A., Sander, C. The ras protein family: evolutionary tree and role of conserved amino acids. Biochemistry. 30 (19), 4637-4648 (1991).
- Hall, A. Rho family GTPases. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1378-1382 (2012).
- Rojas, A. M., Fuentes, G., Rausell, A., Valencia, A. The Ras protein superfamily: evolutionary tree and role of conserved amino acids. The Journal of Cell Biology. 196 (2), 189-201 (2012).
- Cherfils, J., Zeghouf, M. Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs. Physiological Reviews. 93 (1), 269-309 (2013).
- Shojaei, S., et al. Perillyl Alcohol (Monoterpene Alcohol), Limonene. Enzymes. 36, 7-32 (2014).
- Ghavami, S., et al. Airway mesenchymal cell death by mevalonate cascade inhibition: integration of autophagy, unfolded protein response and apoptosis focusing on Bcl2 family proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (7), 1259-1271 (2014).
- Alizadeh, J., et al. Mevalonate Cascade Inhibition by Simvastatin Induces the Intrinsic Apoptosis Pathway via Depletion of Isoprenoids in Tumor Cells. Scientific Reports. 7, 44841 (2017).
- Ghavami, S., et al. Mevalonate cascade regulation of airway mesenchymal cell autophagy and apoptosis: a dual role for p53. PLoS One. 6 (1), e16523 (2011).
- Tang, Y., Olufemi, L., Wang, M. T., Nie, D. Role of Rho GTPases in breast cancer. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 759-776 (2008).
- DerMardirossian, C., Bokoch, G. M. GDIs: central regulatory molecules in Rho GTPase activation. Trends in Cell Biology. 15 (7), 356-363 (2005).
- Garcia-Mata, R., Boulter, E., Burridge, K. The ‘invisible hand’: regulation of RHO GTPases by RHOGDIs. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 493-504 (2011).
- Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
- Ghavami, S., et al. Geranylgeranyl transferase 1 modulates autophagy and apoptosis in human airway smooth muscle. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L420-L428 (2012).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-535 (2000).
- Ghavami, S., et al. Statin-triggered cell death in primary human lung mesenchymal cells involves p53-PUMA and release of Smac and Omi but not cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta. 1803 (4), 452-467 (2010).
- Cordle, A., Koenigsknecht-Talboo, J., Wilkinson, B., Limpert, A., Landreth, G. Mechanisms of statin-mediated inhibition of small G-protein function. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34202-34209 (2005).
- Waiczies, S., Bendix, I., Zipp, F. Geranylgeranylation but not GTP-loading of Rho GTPases determines T cell function. Science Signaling. 1 (12), pt3 (2008).
- Waiczies, S., et al. Geranylgeranylation but not GTP loading determines rho migratory function in T cells. Journal of Immunology. 179 (9), 6024-6032 (2007).
- Satori, C. P., Kostal, V., Arriaga, E. A. Review on Recent Advances in the Analysis of Isolated Organelles. Analytica Chimica Acta. 753, 8-18 (2012).
- Berndt, N., Sebti, S. M. Measurement of protein farnesylation and geranylgeranylation in vitro, in cultured cells and in biopsies, and the effects of prenyl transferase inhibitors. Nature Protocols. 6 (11), 1775-1791 (2011).
- Keely, P. J., Conklin, M. W., Gehler, S., Ponik, S. M., Provenzano, P. P. Investigating integrin regulation and signaling events in three-dimensional systems. Methods in Enzymology. 426, 27-45 (2007).
- Oliver, A. W., et al. The HPV16 E6 binding protein Tip-1 interacts with ARHGEF16, which activates Cdc42. British Journal of Cancer. 104 (2), 324-331 (2011).
- Moniz, S., Matos, P., Jordan, P. WNK2 modulates MEK1 activity through the Rho GTPase pathway. Cellular Signalling. 20 (10), 1762-1768 (2008).
