Erkennung von kleine GTPase Prenylation und GTP binden mit Membran Fraktionierung und GTPase verbundene Immunosorbentprobe Assay
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Prenylation und Guanosin-5′-Triphosphat (GTP) untersuchen-Laden von Rho GTPase. Dieses Protokoll besteht aus zwei detaillierte Methoden, nämlich Membran Fraktionierung und ein GTPase verbundene Immunosorbentprobe assay. Das Protokoll kann verwendet werden, zur Messung der Prenylation und GTP Laden von verschiedenen anderen kleinen GTPasen.
Abstract
Die Rho-GTPase Familie gehört zu den Ras-Superfamilie und umfasst rund 20 Mitglieder in den Menschen. Rho-GTPasen sind wichtig bei der Regulation des diverse zelluläre Funktionen, einschließlich Zellskelett Dynamik, Zelle Motilität Zellpolarität, axonalen Beratung, vesikuläre Menschenhandel und Zellzyklus-Kontrolle. Änderungen bei der Signalisierung Rho GTPase spielen eine wichtige regulatorische Rolle in vielen pathologischen Bedingungen, wie Krebs, Erkrankungen des zentralen Nervensystems und Immunsystem-abhängigen Krankheiten. Die posttranslationale Modifikation der Rho-GTPasen (d.h. Prenylation von Mevalonat Weg Zwischenprodukte) und GTP-Bindung sind wichtige Faktoren, die die Aktivierung dieses Proteins beeinflussen. In diesem Beitrag werden zwei wesentliche und einfache Methoden bereitgestellt, um eine breite Palette von Rho GTPase Prenylation und GTP-Bindung-Aktivitäten zu erkennen. Details der technischen Verfahren, die verwendet wurden erklärt Schritt für Schritt in diesem Manuskript.
Introduction
Rho-GTPasen sind eine Gruppe von kleinen Proteine (21-25 kDa), die sind gut im Laufe der Evolution konserviert, und bilden eine einzigartige Unterfamilie in der Ras-Superfamilie der kleinen GTPasen. In jeder Unterfamilie innerhalb dieser Überfamilie gibt es ein gemeinsame G Domäne-Kern, der die GTPase-Aktivität und Nukleotid Exchange1beteiligt ist. Der Unterschied zwischen der Rho-Familie und den anderen Unterfamilien der Ras ist das Vorhandensein einer “Rho einfügen Domäne” innerhalb der 5th -β-Strang und die 4th -α-Helix in die kleine GTPase Domäne2.
Aufgrund der aktuellen Klassifizierung, Rho-GTPasen gelten eine Familie von Signalproteinen, die in der Ras GTPase-Superfamilie3passen. Säugetier-Rho-GTPasen haben 22 Mitgliedern, die aufgrund ihrer spezifischen Funktion und allgemeine Charakterisierung4 in der RhoA, Rac1 und Cdc42 unter den Mitgliedern die meisten studierte in dieser Gruppe sind. Rho-GTPasen sind intrazelluläre Signal-Wege über einen streng regulierten Mechanismus verbunden, der molekulare Schalter über Protein posttranslationale Modifikationen5abhängig ist.
GTP beladen und Hydrolyse sind wesentliche Mechanismen in den Kreislauf der Aktivierung/Deaktivierung der kleinen Rho-GTPasen und regulierten über GTPase-aktivierende Proteine (Lücken). Lücken sind verantwortlich für die GTP-Hydrolyse und arbeiten im Konzert mit Guanin-Nukleotid Exchange Faktoren (GEFs) die für die GTP-Loading Reaktion verantwortlich sind. Rho BIP Dissoziation Inhibitoren (GDIs) bieten weitere Regulierung der kleinen Rho-GTPasen durch Bindung an die BIP-gebundenen Rho-GTPasen. Dies hemmt BIP Dissoziation und erleichtert die Sequestrierung von kleinen Rho-GTPasen Weg von der aktiven intrazellulären Membran-Websites. Außerdem gibt es weitere Regulierung der Rho-GTPase Proteine mit der Prenylation des GDIs regelt sowohl Nukleotid Hydrolyse und Austausch und Steuerelemente BIP/GTP Radfahren1,6,7,8.
GTP-Loading und Rho GTPase Prenylation sind in der Bewegung der Rho-GTPase zwischen Zytosol und Zellmembranen beteiligt, durch Ändern der lipophilen Eigenschaften dieser Proteine1,9. Die oben genannten Regler interagieren mit Phospholipide der Zellmembran und andere modulierenden Proteine des BIP/GTP Exchange Aktivität10. Darüber hinaus blockieren GDIs, Dissoziation-Inhibitoren, die GTP-Hydrolyse und der BIP/GTP-Austausch. GDIs hemmen die Dissoziation der inaktiven Rho Proteine von BIP und somit ihre Interaktion mit nachgeschalteten Effektoren. GDIs regulieren auch den Radsport GTPasen zwischen Zytosol und Membran in die Zelle. Die Aktivität der Rho-GTPasen hängt zu einem großen Teil ihrer Bewegung an der Zellmembran; So werden GDIs als wichtige Regulatoren angesehen, die im Zytoplasma durch verstecken ihre hydrophoben Region/Domänen11,12GTPasen absondern können.
Für Rho GTPase eine optimale Signal- und Funktion in allen Phasen des Lebenszyklus Aktivierung haben ist der dynamische Zyklus der GTP-laden/GTP Hydrolyse entscheidend. Jede Art von Änderungen in diesem Prozess führen nachträgliche Änderungen in Zellfunktionen Rho GTPase, z. B. Zelle Polarität, Verbreitung, Morphogenese, Cytokinese, Migration, Haftung und überleben13,14geregelt.
Das aktuelle Protokoll bietet den Lesern eine detaillierte Methode, um kleine RhoA GTPase Aktivierung über überwachen die Untersuchung ihrer Prenylation und BIP/GTP beladen. Diese Methode kann auch verwendet werden, die Prenylation und GTP-Bindung eine Vielzahl von kleinen GTPasen zu erkennen. Die GTPase verbundene Immunosorbentprobe Assay kann zur Messung der Aktivierung anderer Arten von GTPasen, wie Rac1, Rac2, Rac3, h-, k- oder N-Ras, Arf und Rho15verwendet werden. Die pharmakologische Agenten Simvastatin dient als Beispiel, wie es vor kurzem berichtet wurde, beteiligt an der Regulation des kleinen Rho GTPase Prenylation und Aktivität8,9,14,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir eine genaue Methode zur Messung der kleine GTPase Prenylation und GTP-Bindung als kleine GTPase subzelluläre Lokalisation (Membran gegen Zytosol) und Rho GTP laden gezeigt. Kleinen GTPasen sind in eukaryotischen Zellen und spielen eine entscheidende Rolle in der Zellproliferation, Motilität und Struktur. Prenylation und GTP-Bindung engagieren sich bei der Regulierung der GTPase-Aktivität; Tests zur Bewertung der Prenylation und GTP-Bindung dieser Proteine sind daher wichtige Werkzeuge fü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Saeid Ghavami war Gesundheit Wissenschaft Mitte in Betrieb, CHRIM Grant und Manitoba neue Ermittler Betrieb Forschungsstipendium in Betrieb unterstützt. Javad Alizadeh unterstützte Forschung Manitoba Zugehörigkeit. Shahla Shojaei wurde durch eine Finanzhilfe von Gesundheit Wissenschaft Stiftung und die MITACS beschleunigen postdoctoral Fellowship unterstützt. Adel Rezaei Moghadam wurde unterstützt durch eine NSERC Betrieb Zuschuss von Joseph W. Gordon stattfand. Amir A. Zeki wurde von den NIH/NHLBI K08-Award (1K08HL114882-01A1) unterstützt. Marek J. Los bitte würdigt die Unterstützung von NCN gewähren #2016/21/B/NZ1/02812, von LE STUDIUM Institute for Advanced Studies (Region Centre-Val de Loire, Frankreich) durch seine intelligente Loire Tal allgemeine Programm unterstützt und mitfinanziert von Marie Sklodowska-Curie-Maßnahmen, gewähren #665790. Simone da Silva Rosa wurde von UMGF Zugehörigkeit unterstützt.
Materials
| DMEM high Glucose | VWR (Canada) | VWRL0101-0500 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR (Canada) | CA45001-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR (Canada) | 97062-806 | |
| EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CA71007-118 | |
| EGTA (Ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) | VWR (Canada) | CAAAJ60767-AE | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | VWR (Canada) | CA97061-340 | |
| Ammonium Persulfate | VWR (Canada) | CABDH9214-500G | |
| Tris-Hydroxymethylaminomethane | VWR (Canada) | CA71009-186 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution | Biorad (Canada) | 1610158 | |
| TEMED | Biorad (Canada) | 1610801 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma/Aldrich (Canada) | P8340-5ML | 1:75 dilution |
| Rho-GTPase Antibody Sampler Kit | Cell Signaling (Canada) | 9968 | 1:1000 dilution |
| Pan-Cadherin antibody | Cell Signaling (Canada) | 4068 | 1:1000 dilution |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology (USA) | sc-69778 | 1:3000 dilution |
| RhoA G-LISA Activation Assay (Luminescence format) | Cytoskeleton Inc. (USA) | BK121 | Cytoskeleton I. G-LISA Activation Assays Technical Guide. 2016. |
| RhoA Antibody | Cell Signaling | 2117 | |
| ECL | Amersham-Pharmacia Biotech | RPN2209 | |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule) Peroxidase antibody | Sigma | A6154-1ML | |
| SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | 1612071A | Spectrophotometer |
| Nonidet P-40 | Sigma | 11332473001 | non-denaturing detergent, octylphenoxypolyethoxyethanol |
| DMSO | Sigma | D8418-50ML | |
| PBS | Sigma | P5493-1L | |
| Phophatase Inhibitor cocktail | Sigma | P5726-5ML | 1:75 Dilution |
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