Isolement et Extraction de l’ARN des neurones, les Macrophages et les cellules microgliales du cerveau de larves de poisson zèbre

1. échantillonnage et préparation des médias Préparer les moyennes de l’embryon (E3) en dissolvant 6,4 mM KCl, 0,22 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2 2 H2O, 0,33 mM MgSO4 7 H2O H2O. Recueillir des embryons de poisson-zèbre immédiatement après la fécondation (0 dpf). Diviser des embryons de poisson-zèbre en 50 par 90 mm boîte de Pétri. Soulever les embryons à 28,5 ° C dans 50 mL de milieu de l’embryon (E3) traité avec 200 µM 1-phényl 2-thiourée (PTU), de la fin de la première journée du développement (0 dpf) pendant la durée de l’expérience pour inhiber la pigmentation. Changement l’E3 + PTU moyennes par jour pendant la durée de l’expérience. Mpeg1:eGFP d’écran et des larves de NBT:DsRed à 2 dpf utilisant un stéréomicroscope fluorescent d’expression du transgène positive, GFP+ macrophages/microglie et DsRed+ neurones. Préparez tous les médias le jour avant l’expérience sous une hotte de culture de tissus pour éviter la contamination, puis les stocker à 4 ° C. Préparer les médias A en dissolvant 15 Hepes et 25 mM D-Glucose en HBSS 1 x. Préparer le milieu de gradient de densité (100 %) en mélangeant 9 volumes du milieu de gradient de densité 1 volume de HBSS 10 x. Préparer le milieu de gradient de densité (22 %), en diluant 22 mL de milieu de gradient de densité (100 %) à 88 mL de SPD 1 x. Préparer le SPD 1 x. Préparer des E3 moyen + tricaïne en mélangeant E3 moyen avec 450 μM tricaïne. 2. homogénéisation Remarque : Toutes les étapes sont exécutées 4 ° C. Ajouter 1,5 mL de tricaïne (15 mM) à 90 mm de Pétri contenant 50 larves dans 50 mL de milieu d’embryon E3 traité avec 200µm PTU à anesthésier en phase terminale eux. Aspirer 10 larves anesthésiés depuis les boîtes de Pétri avec une pipette en plastique en vrac Pasteur de 3 mL. Larves de transfert anesthésié 10 par 10 dans une boîte de Pétri 55 mm rempli de glacee moyen d’embryon E3 + tricaïne. Sous un stéréomicroscope, aligner 10 larves dans le centre de la boîte de Pétri. Puis transect larves tête hors du sac vitellin à l’aide de micro-ciseaux chirurgicaux (exclure la vessie natatoire pour éviter flottant têtes). Aspirer les chefs des boîtes de Pétri avec une pipette en plastique en vrac Pasteur de 3 mL. Attendez que toutes les têtes se rassemblent au sein de l’embout de la pipette et puis de les transférer dans un homogénéisateur de verre contenant 1 mL glacee Media A (transfert dans un volume minimal pour réduire les médias une dilution par E3 + tricaïne). Garder l’homogénéisateur de verre sur la glace. Utilisez un homogénéisateur par condition expérimentale. Remplacer chaque petite boîte de Pétri contenant de glace froide E3 + tricaïne avec un nouveau toutes les 30 minutes afin d’assurer que la résection est effectuée en froid E3 + tricaïne moyen. Remplacer le glacé A de médias de l’homogénéisateur de verre fondu au démarrage la couleur.Remarque : Dilution A Media peut altérer le tissu de siège en raison de changements de température. Une fois que tous les chefs ont été collectées (600 têtes/État), supprimer le volume maximum de médias A de l’homogénéisateur de verre et la remplacer par 1 mL frais glacé Media a Perturber le tissu de cerveau avec un homogénéisateur verre serré sur la glace. Effectuer 40 tours de broyage et de tours pour 3-5 larves de dpf et 50 pour les larves de dpf 7 et 8. Ajouter 2 mL de médias A suspension cellulaire (1 mL médias / 200 têtes), qui va diluer les cellules et réduire leur agglomération avec la myéline pour faciliter leur séparation pendant la centrifugation dans milieu de gradient de densité. Pour éliminer l’agglomération de cellule, exécutez la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule de 40 µm placé au dessus d’un tube de faucon de froid 50 mL maintenu sur la glace. Répéter cette opération 3 fois. Transférer 1 mL de suspension cellulaire dans des tubes à froid 1,5 mL et leur filer à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Retirez le surnageant à l’aide d’une seringue de 10 mL + aiguille 23 x 1”. Resuspendre le culot cellulaire avec 1 mL de milieu dégradé de glacee 22 % densité délicatement recouvert par 0,5 mL de SPD glacée 1 x (do mélangez pas à eux, une interphase entre les deux solutions on le verra). Faites tourner les tubes à 950 g sans frein et d’accélération lente pendant 30 min à 4 ° C.Remarque : Cette étape sépare de la myéline des autres cellules par séquestration il à l’interphase de SPD 1 x et milieu gradient de densité de 22 %, alors que les cellules seront granulé au fond du tube. Enlèvement de la myéline est plus efficace quand la concentration cellulaire n’est pas trop élevée. En utilisant une seringue de 10 mL + aiguille 23 x 1” jeter le maximum de SPD, milieu de gradient de densité et la myéline piégé à leur interphase. Laver les cellules avec 0,5 mL de médias A + 2 % de sérum de chèvre normal (NGS), puis faites tourner les tubes à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant au maximum, puis mettre en commun toutes les boulettes de cellule de la même condition expérimentale ensemble dans 1 mL de médias + 2 % NGS. Si les cellules d’intérêt expriment une protéine fluorescente comme macrophages/microglie de mpeg1:eGFP ou les neurones des NBT:DsRed poissons transgéniques (dépistage des poissons transgéniques voir 1.1.3), exécutez la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule 35 µm cap et transférez-les dans un tubes froid 5 mL FACS sur ice, abri de la lumière.Remarque : Par ailleurs, immunomarquage des microglies peut être effectuée. 3. la microglie Immuno-coloration Remarque : Toutes les mesures sont effectuées à 4 ° C. Resuspendre le culot cellulaire avec 0,3 mL de médias + 2 % NGS. Divisez-les en tubes de 3 x 1,5 mL : un pour les cellules incolores sur mesure auto-fluorescence des cellules d’intérêt, deuxième pour l’anticorps secondaire (1/200) mesurer la liaison non spécifique de l’anticorps secondaire dans la microglie et troisième comme un test (4 4 souris monoclonal anticorps (microglies spécifique) (1/20) + anticorps secondaire (1/200)). Ajouter faible endotoxine, exempte d’azoture (feuille) à 1 % pour les cellules (tous les tubes) pour bloquer les interactions CD16/CD32 avec le domaine Fc des immunoglobulines. Incuber les cellules pendant 10 min avec agitation douce toutes les 5 min. Ajouter les 4 4 anticorps (1/20) aux cellules (tube 3) et incuber pendant 30 minutes avec agitation douce toutes les 10 min. Faites tourner les tubes à 300 g pendant 10 min à 4 ° C, puis jeter le surnageant. Laver une fois avec 0,5 mL de médias A + 2 % NGS, puis essorer tubes à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Une nouvelle suspension du culot avec 0,5 ml de médias + 2 % NGS et incuber les cellules avec des feuilles à 1 % pendant 10 min avec agitation douce toutes les 5 min. Ajoutez l’anticorps secondaire (1/200) aux cellules (tube 2 et 3). Incuber les cellules pendant 30 min avec agitation douce toutes les 10 min et protection contre la lumière. Faites tourner les tubes à 300 g pendant 10 min à 4 ° C, puis jeter le surnageant. Laver deux fois avec 0,5 mL de médias + 2 % NGS, puis remettre en suspension le culot cellulaire avec 1 mL de médias + 2 % NGS. Exécuter la suspension cellulaire en établissant un plafond de crépine 35 µm cellulaire et de les transférer dans des tubes à froid 5 mL FACS sur ice, abri de la lumière. 4. cellule triant (FACS) Remarque : Effectuez toutes les opérations à 4 ° C. Trier les neurones, macrophages/microglie et la microglie en utilisant un FACS.Remarque : Cette étape est généralement effectuée par un membre du personnel de l’installation de FACS et paramètres dépendent du type de matériel utilisé. Ajouter DAPI à une concentration de 1 µg/mL dans chaque tube de FACS d’étiqueter les cellules mortes. Définir les neurones FACS et tri, macrophages/microglie ou microglie de toutes les cellules du cerveau. Séparer les cellules des débris en fonction de leur taille et la granularité, puis single-cellules de forward scatter et diffusion latérale de la porte. Exclure les cellules mortes par DAPI marquage de cellules vivantes. Identifier les neurones, les macrophages/microglie ou microglie par leur coloration positive respectifs. Prélever des cellules dans des tubes de 1,5 mL contenant 1 mL de glacé de médias A + de 2 % end sur la glace. Utilisez des tubes différents pour chaque type de cellule. Faites tourner les tubes à 300 g pendant 10 min à 4 ° C et ensuite jeter le surnageant. Laver une fois avec 0,5 mL de médias A puis jeter le liquide surnageant au maximum. 5. Extraction de l’ARN Extrait les différents types de cellules séparées par des FACS de RNA. Pour extraire l’ARN utilise un kit spécifique et suivre les directives du fabricant. Vérifier que vous travaillez dans un environnement libre de RNase par espace de travail de nettoyage et des pipettes avec un produit de décontamination de RNase et utiliser des pointes à filtre. Fraîchement préparer 1 mL de tampon de lyse additionné de 50 µM de β-mercaptoéthanol.Remarque : Ici, les β-mercaptoéthanol est ajouté pour réduire la dégradation de l’ARN. Préparer de solution d’éthanol à 70 % et 80 % à l’aide de RNase eau gratuite. Lyse des cellules avec 75 µL de tampon de lyse additionné de 50 µM de β-mercaptoéthanol. Puis utilisez un broyeur pour améliorer la désorganisation de la cellule. Continuer le Guide de l’extraction de l’ARN selon le fabricant. À la fin du protocole, éluer l’ARN avec 14 µL d’eau libre de RNase pour obtenir une concentration suffisante d’ARN.