Isolatie en RNA extractie van neuronen, macrofagen en Microglia van larvale Zebrafish hersenen

1. steekproef en voorbereiding van de Media Bereiden van embryo medium (E3) door het oplossen van 6,4 mM KCl 0,22 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2 2 H2O, 0.33 mM MgSO4 7 H2O in H2O. Verzamelen zebrafish embryo’s onmiddellijk na de bevruchting (0 dpf). Zebravis embryo’s gesplitst 50 per 90 mm petrischaal. Verhogen van embryo’s bij 28,5 ° C in 50 mL embryo voedingsbodem (E3) behandeld met 200 µM 1-fenyl-2-thioureum (FTU), vanaf het einde van de eerste dag van ontwikkeling (0 dpf) voor de duur van het experiment voor de remming van de pigmentatie. Verandering de E3 + FTU medium dagelijks voor de duur van het experiment. Scherm mpeg1:eGFP en NBT:DsRed larven op 2 dpf met behulp van een TL stereomicroscoop voor positieve transgenic expressie, macrofagen/microglia GFP+ DsRed+ neuronen. Bereiden alle media de dag voordat het experiment onder de motorkap van een weefselkweek om verontreiniging te vermijden, dan bewaren bij 4 ° C. Bereiden van media A door het oplossen van 15 mM Hepes en 25 mM D-Glucose in HBSS 1 x. Bereid de kleurovergang medium dichtheid (100%) door het mengen van 9 volumes van het medium dichtheid kleurovergang in 1 deel HBSS 10 x. Voorbereiden van het dichtheid kleurovergang medium (22%) door verder verdunnen van 22 mL van de kleurovergang medium dichtheid (100%) in 88 mL DPBS 1 x. Bereiden van DPBS 1 x. Bereid E3 medium + tricaïne door het mengen van E3 medium met 450 μM tricaïne. 2. de homogenisering Opmerking: Alle stappen zijn uitgevoerd 4 ° C. 1,5 mL tricaïne (15 mM) aan 90 mm petrischalen met 50 larven in 50 mL E3 embryo voedingsbodem behandeld met 200 µM FTU aan terminaal anesthetize hen toevoegen. 10 narcose larven uit de petrischaaltjes met een 3 mL Pipet van Pasteur kunststof bulk opzuigen. Overdracht verdoofd larven 10 van de 10 in een petrischaal 55-mm gevuld met ijskoude E3 embryo medium + tricaïne. Uitlijnen onder een stereomicroscoop, 10 larven in het midden van de petrischaal. Vervolgens transect larvale hoofd boven de dooierzak met behulp van chirurgische micro-schaar (uitsluiten zwemblaas Voorkom hoofden zweven). Hoofden van de petrischaaltjes met een 3 mL Pipet van Pasteur kunststof bulk opzuigen. Wacht tot alle hoofden binnen het uiteinde van de pipet verzamelen en breng ze in een glazen homogenizer met 1 mL ijskoud Media A (transfer in een minimale volume voor het verminderen van de Media een verdunning door E3 + tricaïne). Houd het glas-homogenizer op het ijs. Gebruik één homogenizer per experimentele voorwaarde. Vervang elke kleine petrischaal met ijs koud E3 + tricaïne met een nieuwe elke 30 minuten om te verzekeren dat transect wordt uitgevoerd in koude E3 + tricaïne medium. Vervang de ijskoude Media A in het glas-homogenizer zodra de kleur vervagen.Opmerking: Media A verdunning kan veranderen het hoofd weefsel als gevolg van temperatuurveranderingen. Zodra alle hoofden zijn verzameld (600 hoofden/voorwaarde), het maximale volume van Media A verwijderen met de glas homogenizer en te vervangen door 1 mL verse ijskoude Media A. Het verstoren van het hersenweefsel met een strakke glas homogenizer op ijs. 40 ronden van breken en bochten voor 3-5 dpf larven en 50 voor 7 en 8 dpf larven uitvoeren. Voeg 2 mL van Media A tot celsuspensie (1 mL Media A / 200 hoofden), die zal verdund cellen en hun agglomeratie met myeline ter vergemakkelijking van hun scheiding tijdens het centrifugeren in de kleurovergang medium dichtheid te verminderen. Om te elimineren cel agglomeratie, de celsuspensie worden uitgevoerd door een zeef van 40 µm cel geplaatst op de top van een koude 50 mL falcon buis gehandhaafd op het ijs. Herhaal deze bewerking 3 keer. Pipetteer 1 mL celsuspensie in koude 1,5 mL buizen en draaien ze bij 300 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van een 10 mL spuit + naald 23G x 1”. Resuspendeer de pellet cel met 1 mL van ijskoude 22% dichtheid kleurovergang medium zachtjes bedekt door 0,5 mL ijskoud DPBS 1 x (do niet mix hen, een interfase tussen beide oplossingen zal worden gezien). Spin buizen op 950 g zonder rem en langzame versnelling gedurende 30 minuten bij 4 ° C.Opmerking: Deze stap scheidt myeline uit andere cellen door het vastleggen op de interfase van DPBS 1 x en 22% dichtheid kleurovergang medium, overwegende dat cellen aan de onderkant van de buis pellet zal. Verwijdering van de myeline is efficiënter als cel concentratie niet te hoog is. Met behulp van een 10 mL spuit + naald 23G x 1” negeren het maximum van DPBS, de kleurovergang medium dichtheid en myeline gevangen op hun interfase. Cellen met 0,5 mL van Media A + 2% van de normale geit serum (NGS) wassen, dan draaien buizen bij 300 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Het maximum van de bovendrijvende vloeistof verwijderen, dan bundelen alle pellets van de cel van de dezelfde experimentele conditie samen in 1 mL van Media A + 2% NGS. Als de cellen van belang express een fluorescente proteïne zoals macrofagen/microglia van mpeg1:eGFP of neuronen van NBT:DsRed transgene vis (screening van transgene vis zie 1.1.3), de celsuspensie doorlopen een 35 µm cel zeef cap en overbrengen in een koude 5 mL FACS buizen op ijs, beschermd tegen licht.Opmerking: Als alternatief, immuno-kleuring van microglia kan worden uitgevoerd. 3. Microglia Immuno-kleuring Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet cel met 0.3 mL Media A + 2% NGS. Opgesplitst in 3 x 1,5 mL buizen: één voor onbevlekt cellen op maat auto-fluorescentie uit cellen van belang, ten tweede voor het secundaire antilichaam (1/200) voor het meten van de niet-specifieke binding van het secundaire antilichaam microglia en derde als een test (4C 4 muis monoclonal antilichaam (microglia specifieke) (1/20) + secundair antilichaam (1/200)). Toevoegen lage endotoxinen, Azide-Free (blad) bij 1% naar cellen (alle buizen) te blokkeren CD16/CD32 interacties met het Fc-domein van immunoglobulinen. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten met zachte agitatie elke 5 min. Toevoegen van de 4C 4 antilichaam (1/20) naar cellen (buis 3) en incubeer gedurende 30 min met zachte agitatie elke 10 min. Spin buizen bij 300 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, en vervolgens de vloeistof wordt weggeworpen. Wassen zodra met 0,5 mL van Media A + 2% NGS, draai vervolgens buizen bij 300 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Resuspendeer cel pellet met 0,5 ml van Media A + 2% NGS en Incubeer de cellen met blad op 1% voor 10 min met zachte agitatie elke 5 min. Secundair antilichaam (1/200) aan cellen (buis 2 en 3) toevoegen. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten met zachte agitatie elke 10 min en lichte bescherming. Spin buizen bij 300 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, dan wordt weggeworpen. Wassen tweemaal met 0,5 mL Media A + 2% NGS en resuspendeer cel pellet met 1 mL Media A + 2% NGS. Celsuspensie doorlopen een 35 µm cel zeef cap en ze vervolgens overbrengen naar koude 5 mL FACS buizen op ijs, beschermd tegen licht. 4. cell Sorting (FACS) Opmerking: Voer alle stappen uit bij 4 ° C. Sorteren van neuronen, macrofagen/microglia en microglia met behulp van een FACS.Opmerking: Deze stap wordt doorgaans uitgevoerd door een personeelslid van de FACS faciliteit en instellingen is afhankelijk van de gebruikte soort apparatuur. DAPI op een concentratie van 1 µg/mL in elke buis FACS label dode cellen toevoegen. FACS en sorteren neuronen, macrofagen/microglia of instellen microglia uit alle hersencellen. Afzonderlijke cellen uit puin in functie van hun grootte en granulariteit, dan poort single-cellen door voorwaartse scatter en kant scatter. Dode cellen van de DAPI etikettering van levende cellen uitsluiten. Neuronen, macrofagen/microglia of microglia identificeren door hun respectieve positieve kleuring. Verzamelen van cellen in 1,5 mL buisjes met 1 mL ijskoud Media A + 2% NGS op ijs. Gebruik verschillende buizen voor elk celtype. Spin buizen bij 300 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en vervolgens wordt de weggeworpen. Wassen zodra met 0,5 mL van Media een dan het maximum van de bovendrijvende vloeistof verwijderen. 5. RNA extractie Het uittreksel van RNA van de verschillende soorten cellen gescheiden door FACS. Gebruik een specifieke kit voor RNA extractie en volg de richtlijnen van de fabrikant. Zorg ervoor om te werken in een omgeving RNase gratis door schoonmaak werkruimte en pipetten met een product van de decontaminatie RNase filter geboden tips te gebruiken. Vers bereiden 1 mL lysis-buffermengsel aangevuld met 50 µM β-mercaptoethanol.Opmerking: Hier, wordt β-mercaptoethanol toegevoegd aan het verminderen van de aantasting van het RNA. Bereiden van 70% en 80% ethanol oplossing met behulp van RNase gratis water. Lyse cellen met 75 µL van lysis buffer aangevuld met 50 µM β-mercaptoethanol. Gebruik vervolgens een shredder om verstoring van de cel. Blijven RNA extractie volgens fabrikant handleiding. Aan het eind van het protocol, elueer de RNA met 14 µL van RNase gratis water om te verkrijgen van een concentratie van RNA.