Aislamiento y extracción de ARN de las neuronas, macrófagos y Microglia de cerebros de larvas de pez cebra

1. la muestra y la preparación de los medios de comunicación Preparar medio embrión (E3) disolviendo 6,4 mM KCl, NaCl de 0,22 mM, 0,33 mM CaCl2 2 H2O, 0,33 mM MgSO4 7 H2O H2O. Recolectar embriones de pez cebra inmediatamente después de la fertilización (PD 0). Embriones de pez cebra se dividió en 50 por plato de petri de 90 mm. Crear embriones a 28,5 ° C en 50 mL de medio de embrión (E3) tratado con 200 μm 1-fenil 2-tiourea (PTU), desde el final del primer día de desarrollo (PD 0) para la duración del experimento para inhibir pigmentación. Cambio el E3 + PTU mediana diariamente para la duración del experimento. Pantalla mpeg1:eGFP y NBT:DsRed larvas en 2 PD con un estereomicroscopio fluorescente para la expresión de transgenes positivo, GFP+ los macrófagos/microglía y DsRed+ las neuronas. Preparar todos los medios el día antes del experimento bajo una campana de cultivo de tejidos para evitar la contaminación, a continuación, almacenar a 4 ° C. Preparar los medios de comunicación A disolviendo 15 mM Hepes y 25 mM D-glucosa en HBSS 1 x. Preparar medio de gradiente de densidad (100%) mediante la mezcla de 9 volúmenes de medio de gradiente de densidad en 1 volumen de HBSS 10 x. Preparar el medio de gradiente de densidad (22%) diluyendo 22 mL de medio de gradiente de densidad (100%) de 88 mL de DPBS 1 x. Preparar DPBS 1 x. Preparar medio de E3 + Tricaine mezclando medio E3 con 450 μM Tricaine. 2. homogeneización Nota: Todos los pasos están realizados 4 ° C. Añadir 1.5 mL Metanosulfonato (15 mM) a platos de Petri de 90 mm que contienen larvas de 50 en 50 mL de medio de embrión de E3 tratado con 200 μm de PTU para anestesiar terminal les. Chupar hasta 10 larvas anestesiadas de los platos de petri con una pipeta de plástico a granel Pasteur de 3 mL. Transferencia anestesiado larvas 10 por 10 en un plato de petri de 55 mm llenan de helado medio embrión de E3 + Tricaine. Bajo un estereomicroscopio, alinear 10 larvas en el centro de la caja Petri. Entonces transecto cabezas larvas sobre el saco vitelino mediante micro-tijeras quirúrgicas (excluir vejiga natatoria para evitar flotación cabezas). Chupar cabezas de los platos de petri con una pipeta de plástico a granel Pasteur de 3 mL. Espere hasta que todas las cabezas se reúnen en la punta de la pipeta y luego transfieren en un homogeneizador de vidrio que contengan 1 mL A helada de los medios de comunicación (transferencia de un volumen mínimo para reducir los medios de comunicación una dilución por E3 + Metanosulfonato). Mantenga el homogenizador de vidrio en el hielo. Uso de un homogeneizador por condición experimental. Reemplazar cada pequeño placa de Petri que contiene hielo frío E3 + Metanosulfonato con uno nuevo cada 30 minutos para asegurar que corte transversal se realiza en frío E3 + Tricaine medio. Vuelva a colocar la helada A los medios de comunicación en el homogenizador de vidrio cuando el color se descolora.Nota: Dilución de A los medios de comunicación puede alterar el tejido de la cabeza debido a los cambios de temperatura. Una vez que se han recogido todas las cabezas (600 cabezas/condición), retire el volumen máximo de la multimedia al homogeneizador de vidrio y sustituirla por 1 mL fresca helada a los medios de comunicación. Afectar el tejido cerebral con un homogeneizador de vidrio firmemente en el hielo. Realizar 40 rondas de trituración y vueltas para 3-5 larvas de PD y 50 para las larvas de dpf 7 y 8. Añadir 2 mL del medio A suspensión de la célula (1 mL A los medios de comunicación / 200 cabezas), que se diluya las células y reducir su aglomeración con mielina para facilitar su separación durante la centrifugación en gradiente medio de densidad. Para eliminar la aglomeración de células, ejecutar la suspensión de células a través de 40 μm células colador colocado encima de un tubo de frío 50 mL falcon mantenido en hielo. Repetir esta operación 3 veces. Transfiera 1 mL de la suspensión celular en tubos de 1,5 mL frío y centrifugado a 300 g durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante utilizando una jeringa de 10 mL + aguja 23 x 1”. Resuspenda el sedimento celular con 1 mL de helado 22% densidad gradiente medio suavemente overlaid por 0,5 mL de DPBS helada 1 x (do no mezcla de ellos, una interfase entre ambas soluciones se verá). Girar los tubos a 950 g sin freno y aceleración lento durante 30 min a 4 ° C.Nota: Este paso separa del myelin de otras células por secuestrar en la interfase de DPBS 1 x y 22% medio gradiente de densidad, mientras que células se de pellets en la parte inferior del tubo. Eliminación de la mielina es más eficiente cuando la concentración de células no es demasiado alto. Utilizando una jeringa de 10 mL + descarte aguja 23 x 1” el máximo de DPBS, medio de gradiente de densidad y mielina atrapado en su interfase. Lavar las células con 0,5 mL del medio A + 2% de suero normal de cabra (NGS), luego gire tubos a 300 g durante 10 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante al máximo, entonces todos los pellets de celular de la misma condición experimental en 1 mL de medio A + 2% de la piscina NGS. Si las células de interés expresan una proteína fluorescente como los macrófagos/microglía de mpeg1:eGFP o las neuronas de NBT:DsRed peces transgénicos (proyección de peces transgénicos ver 1.1.3), ejecutar la suspensión de células a través de un tamiz de 35 μm celular tapón y transfieren a un tubos de 5 mL frío FACS en el hielo, protegidos de la luz.Nota: Alternativamente, se puede realizar inmuno-tinción de microglia. 3. Microglia inmuno-tinción Nota: Todas las medidas se realizan a 4 ° C. Resuspenda el sedimento celular con 0,3 mL de medios de comunicación A + 2% NGS. Dividir en tubos de 3 x 1,5 mL: uno de células sin manchas medir auto fluorescencia de las células de interés, en segundo lugar para que el anticuerpo secundario (1/200) medir la Unión inespecífica del anticuerpo secundario a la microglia y el tercero como prueba (4 de 4 ratón monoclonal anticuerpo (microglia específica) (1/20) + (1/200) de anticuerpo secundario). Agregar baja endotoxina, libre de azida (hoja) al 1% a las células (los tubos) para bloquear las interacciones CD16/CD32 con el dominio Fc de las inmunoglobulinas. Incube las células por 10 min con suave agitación cada 5 min. Añadir los 4 4 anticuerpos (1/20) a las células (tubo 3) e incubar por 30 min con suave agitación cada 10 minutos. Girar los tubos a 300 g durante 10 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante. Lavar una vez con 0,5 mL del medio A + 2% NGS, luego girar tubos a 300 g durante 10 min a 4 ° C. Resuspenda el sedimento celulares con 0,5 ml de medios de comunicación A + 2% NGS e incubar las células con la hoja en el 1% por 10 min con suave agitación cada 5 min. Añadir el anticuerpo secundario (1/200) a las células (tubo de 2 y 3). Incube las células por 30 min con suave agitación cada 10 min y la protección de la luz. Girar los tubos a 300 g durante 10 min a 4 ° C, luego deseche el sobrenadante. Lave dos veces con 0,5 mL de medios de comunicación A + 2% NGS, luego vuelva a suspender el sedimento celulares con 1 mL de medio A + 2% NGS. Ejecutar la suspensión de células a través de una tapa de filtro 35 μm células y transferirlos en tubos de 5 mL frío FACS en el hielo, protegido de la luz. 4. clasificación (FACS) de la célula Nota: Realizar todos los pasos a 4 ° C. Clasificar las neuronas, los macrófagos/microglía y microglia usando un FACS.Nota: Este paso generalmente se realiza por un miembro del personal de la instalación del FACS y ajustes dependen del tipo de equipo utilizado. Añadir DAPI en una concentración de 1 μg/mL en cada tubo de FACS para etiquetar las células muertas. Configurar las neuronas FACS y tipo, los macrófagos/microglía o microglia de todas las células del cerebro. Separar las células de residuos en función de su tamaño y granularidad, a continuación solo las células por dispersión hacia delante y la dispersión lateral de la puerta. Excluir las células muertas, DAPI etiquetado de células vivas. Identificar las neuronas, los macrófagos/microglía o microglía por su respectiva coloración positiva. Recoger las células en tubos de 1,5 mL que contiene 1 mL de helado A Media + 2% NGS en hielo. Utilizar tubos diferentes para cada tipo de célula. Girar los tubos a 300 g durante 10 min a 4 ° C y luego descartar el sobrenadante. Lavar una vez con 0,5 mL de medios de comunicación un entonces deseche el máximo de sobrenadante. 5. extracción RNA Extraiga el RNA de los diferentes tipos de células separados por FACS. Para la extracción de RNA utiliza un kit específico y siga las instrucciones del fabricante. Asegúrese de trabajar en un ambiente libre de Rnasa por espacio de trabajo de limpieza y pipetas con un producto de descontaminación de RNasa y utilizar las puntas de filtro. Recién preparar 1 mL de tampón de lisis suplementado con 50 μm β-mercaptoetanol.Nota: Aquí, β-mercaptoetanol es añadido para reducir la degradación del RNA. Preparar solución de etanol 70% y 80% usando Rnasa agua libre. Lyse las células con 75 μl de tampón de lisis suplementado con 50 μm β-mercaptoetanol. Utilizar una trituradora para mejorar la interrupción de la célula. Seguir el manual de extracción de RNA según fabricante. Al final del Protocolo, eluir el RNA con 14 μl de agua libre de ARNasa para obtener una concentración suficiente de RNA.