Isolation und RNA-Extraktion von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirne

1. Probe und Medien-Vorbereitung Bereiten Sie Embryo Medium (E3) durch Auflösen von 6,4 mM KCl, 0,22 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2 2 H2O, 0,33 mM MgSO4 7 H2O in H2O. Sammeln Sie Zebrafish Embryos sofort nach der Befruchtung (0 Dpf). 50 pro 90 mm Petrischale Zebrafisch-Embryonen aufgeteilt. Heben Sie Embryonen bei 28,5 ° C in 50 mL Embryo Medium (E3) behandelt mit 200 µM 1-Phenyl-2-Thioharnstoff (PTU), vom Ende des ersten Tages der Entwicklung (0 Dpf) für die Dauer des Experiments Pigmentierung zu hemmen. Änderung der E3 + PTU Medium täglich für die Dauer des Experiments. -Mpeg1:eGFP und NBT:DsRed Larven bei 2 Dpf mit fluoreszierendem Stereomikroskop für positive Transgene Ausdruck, GFP+ Makrophagen/Mikroglia und DsRed+ Neuronen. Bereiten Sie alle Medien der Tag vor dem Experiment unter einer Gewebekultur Haube zur Vermeidung von Kontaminationen, dann bei 4 ° c Lagern Bereiten Sie Medien A durch Auflösen von 15 mM Hepes und 25 mM D-Glucose in HBSS 1 X. Bereiten Sie Dichte Gradienten Medium (100 %) durch Mischen 9 Bände der gradient mittlerer Dichte 1 Volumen von HBSS 10 X. Bereiten Sie das Dichte Gradienten Medium (22 %) durch Verdünnung 22 mL Dichte Gradienten Medium (100 %) in 88 mL des DPBS 1 X. Bereiten Sie DPBS 1 X. Bereiten Sie E3 Medium + Tricaine durch Mischen E3 Medium mit 450 μM Tricaine. (2) Homogenisierung Hinweis: Alle Schritte sind durchgeführten 4 ° C. 90 mm Petrischalen mit 50 Larven in 50 mL E3 Embryo Medium behandelt mit 200 µM PTU um unheilbar betäuben fügen Sie 1,5 mL Tricaine (15 mM hinzu). 10 narkotisierten Larven von Petrischalen mit einer 3 mL Pasteurpipette Kunststoff Masse aufzusaugen. Transfer betäubt Larven 10 mal 10 in eine 55-mm-Petrischale gefüllt mit eiskalten E3 Embryo Medium + Tricaine. Richten Sie unter einem Stereomikroskop 10 Larven in der Mitte der Petrischale. Dann Transekt Larven Kopf über dem Dottersack mit chirurgischen Mikro-Schere (Schwimmblase zur Vermeidung von schwebenden Köpfe ausschließen). Köpfe von Petrischalen mit einer 3 mL Pasteurpipette Kunststoff Masse aufzusaugen. Warten Sie, bis alle Köpfe innerhalb der Pipettenspitze sammeln und dann in ein Glas-Homogenisator mit 1 mL eiskaltes Media A übertragen (transfer in einem minimalen Volumen, Medien zu reduzieren eine Verdünnung mit E3 + Tricaine). Halten Sie das Glas-Homogenisator auf Eis. Verwenden Sie ein Homogenisator pro versuchsbedingung. Ersetzen Sie jede kleine Petrischale mit Eis kalt E3 + Tricaine mit einer neuen erfolgt alle 30 min. zu versichern, dass Durchtrennung im kalten E3 + Tricaine Medium. Ersetzen Sie das eiskalte Media A in der Glas-Homogenisator, wenn die Farbe verblassen beginnt.Hinweis: Medien A Verdünnung kann der Kopf Gewebe aufgrund von Temperaturänderungen verändern. Sobald alle Köpfe gesammelt wurden (600 Köpfe/Zustand), die maximale Lautstärke von Medien A aus der Glas-Homogenisator entfernen und ersetzen es mit 1 mL frische eiskalte Medien A. Stören Sie das Hirngewebe mit einem engen Glas-Homogenisator auf Eis. Führen Sie 40 runden Zerkleinern und Wendungen für 3-5 Dpf Larven und 50 für 7 und 8 Dpf Larven. Hinzufügen von Medien A 2 mL Zellsuspension (1 mL Media A / 200 Köpfe), das Verdünnen Zellen und verringern ihre Agglomeration mit Myelin um ihre Trennung während der Zentrifugation in Dichte-Gradienten-Medium zu erleichtern. Zelle Agglomeration zu beseitigen, führen Sie die Zellsuspension durch ein 40 µm Zelle Sieb oben auf einer kalten 50 mL Falcon-Röhrchen gepflegt auf Eis gelegt. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3-Mal. 1 mL Zellsuspension in kalten 1,5 mL Röhrchen zu übertragen und mit 300 g für 10 min bei 4 ° c drehen Überstand mit einer 10 mL Spritze entfernen + Nadel 23 x 1”. Wieder aussetzen der Zelle Pellet mit 1 mL eiskaltes 22 % Dichte Gradienten Medium sanft überlagert von 0,5 mL eiskaltes DPBS 1 x (Do nicht mischen sie eine Interphase zwischen beiden Lösungen zu sehen sein). Spin-Rohre bei 950 g ohne Bremse und langsame Beschleunigung für 30 min bei 4 ° C.Hinweis: Dieser Schritt trennt Myelin aus anderen Zellen durch Sequestrierung es in der Interphase des DPBS 1 X und 22 % Dichte Gradienten Medium, während Zellen an der Unterseite des Rohres pellet werden. Myelin-Entfernung ist effizienter, wenn Zellkonzentration nicht zu hoch ist. Verwenden einen 10-mL-Spritze + Nadel 23 x 1” verwerfen das Maximum des DPBS, Dichte-Gradienten-Medium und Myelin gefangen in der Interphase. Waschen Sie Zellen mit 0,5 mL der Medien A + 2 % vom normalem ziegenserum (NGS), dann Spinnen Sie Röhren bei 300 g für 10 min bei 4 ° C. Das Maximum des Überstands zu verwerfen, dann bündeln alle Zelle Pellets aus der gleichen versuchsbedingung zusammen in 1 mL des Medien-A + 2 % NGS. Wenn die Zellen von Interesse zum Ausdruck eines fluoreszierenden Proteins wie Makrophagen/Mikroglia aus Mpeg1:eGFP bringen oder Neuronen aus NBT:DsRed transgene Fische (Screening von transgenen Fischen siehe 1.1.3), laufen die Zellsuspension durch ein Sieb 35 µm Zelle Kappe und übertragen Sie sie in eine kalt 5 mL FACS Röhren auf dem Eis, vor Licht geschützt werden.Hinweis: Alternativ kann die Immuno-Färbung der Mikroglia durchgeführt. (3) Microglia Immuno-Färbung Hinweis: Alle Schritte sind bei 4 ° c durchgeführt. Wieder aussetzen der Zelle Pellet mit 0,3 mL Media A + 2 % NGS. In 3 x 1,5 mL Röhrchen aufgeteilt: eine für ungefärbten Zellen, Auto-Fluoreszenz aus Zellen von Interesse, zum anderen für den sekundären Antikörper (1/200), die unspezifische Bindung des sekundären Antikörpers Mikroglia und drittens als Test Messen Messen (4 4 Maus monoklonalen Antikörper (Mikroglia spezifische) (1/20) + Sekundärantikörper (1/200)). Fügen Sie Low Endotoxin, azid-Free (Blatt) bei 1 % auf Zellen (alle Röhren), CD16/CD32 Interaktionen mit der Fc-Domäne von Immunglobulinen zu blockieren. Inkubieren Sie Zellen für 10 min mit sanften Agitation alle 5 min. Fügen Sie 4 4 Antikörper (1/20), Zellen (Röhre 3) und inkubieren Sie für 30 min unter schonenden rühren alle 10 Minuten. Röhren bei 300 g für 10 min bei 4 ° C drehen, dann den überstand verwerfen. Waschen Sie einmal mit 0,5 mL der Medien A + 2 % NGS, drehen dann Rohre bei 300 g für 10 min bei 4 ° C. Wieder auszusetzen Zelle Pellet mit 0,5 ml Media A + 2 % NGS und Zellen mit Blatt bei 1 % für 10 min mit sanften Agitation alle 5 min inkubieren. Zellen (Rohr 2 und 3) sekundäre Antikörper (1/200) hinzufügen. Inkubieren Sie Zellen für 30 min mit sanften Agitation, alle 10 min und Lichtschutz. Röhren bei 300 g für 10 min bei 4 ° C drehen, dann überstand verwerfen. Waschen zweimal mit 0,5 mL Media A + 2 % NGS, dann wieder auszusetzen Zelle Pellet mit 1 mL Media A + 2 % NGS. Ein 35 µm Sieb Zellenabdeckung durchziehen Sie Zellsuspension und übertragen Sie diese in kalten 5 mL FACS Röhren auf Eis, vor Licht geschützt. (4) Zelle Sortieren (FACS) Hinweis: Führen Sie alle Schritte bei 4 ° C. Sortieren Sie Neuronen, Makrophagen/Mikroglia und Mikroglia mit einem FACS.Hinweis: Dieser Schritt erfolgt in der Regel von einem Mitarbeiter der FACS Facility und Einstellungen hängen von der Art der Ausrüstung verwendet. Fügen Sie DAPI in einer Konzentration von 1 µg/mL in jedem FACS-Röhrchen, abgestorbene Zellen zu kennzeichnen. FACS und Art Neuronen, Makrophagen/Mikroglia oder Mikroglia aus alle Gehirnzellen einrichten. Getrennte Zellen von Schutt in Abhängigkeit von ihrer Größe und Granularität, dann Tor Einzel-Zellen durch forward Scatter und Side Scatter. Schließen Sie aus, indem Sie DAPI Kennzeichnung von lebenden Zellen abgestorbene Zellen. Neuronen, Makrophagen/Mikroglia oder Mikroglia durch ihre jeweiligen positive Färbung zu identifizieren. Sammeln Sie Zellen in 1,5 mL Röhrchen mit 1 mL eiskaltes Media A + 2 % NGS auf Eis. Verwenden Sie verschiedene Schläuche für jeden Zelltyp. Röhren bei 300 g für 10 min bei 4 ° C drehen und dann verwerfen des Überstands. Waschen Sie einmal mit 0,5 mL der Medien eine dann verwerfen die maximale überstand. (5) RNA-Extraktion Die verschiedenen Zelltypen getrennt durch FACS extrahieren Sie RNA. Verwenden Sie für die RNA-Extraktion eine besondere-Installationssatz und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers. Sicherstellen Sie, dass in einer RNase frei Umgebung durch Reinigung Arbeitsbereich und Pipetten mit einem RNase Dekontamination Produkt arbeiten und Filtertips verwenden. Frisch bereiten Sie 1 mL Lyse-Puffer mit 50 µM β-Mercaptoethanol ergänzt zu.Hinweis: Hier wird β-Mercaptoethanol hinzugefügt, um RNA-Abbau zu reduzieren. Bereiten Sie 70 % und 80 % Ethanol-Lösung mit RNase freies Wasser. Lösen Sie Zellen mit 75 µL Lyse Puffer mit 50 µM β-Mercaptoethanol ergänzt. Verwenden Sie dann einen Schredder Zellaufschluss zu verbessern. RNA-Extraktion laut Hersteller der Bedienungsanleitung weiter. Am Ende des Protokolls eluieren der RNS mit 14 µL RNase freies Wasser um eine ausreichende RNA-Konzentration zu erhalten.