العزلة واستخراج الحمض النووي الريبي للخلايا العصبية والضامة وميكروجليا من العقول الزرد اليرقات
Summary
نقدم بروتوكولا لعزل الخلايا العصبية والضامة وميكروجليا من العقول الزرد اليرقات تحت الظروف الفسيولوجية والمرضية. إلى العزلة، يتم استخراج الحمض النووي الريبي من هذه الخلايا لتحليل تلك الشخصية التعبير الجيني. يسمح هذا البروتوكول لجمع الحمض النووي الريبي عالية الجودة لإجراء تحليل المتلقين للمعلومات مثل قبكر وترانسكريبتوميكس.
Abstract
للحصول على فهم مفصل لدور خلايا الجهاز العصبي المركزي مختلفة أثناء تطوير أو إنشاء وتطور الأمراض الدماغ، من المهم أن عزل هذه الخلايا دون تغيير صورتهم التعبير الجيني. يوفر النموذج الزرد عدد كبير من خطوط الأسماك المحورة وراثيا التي يتم وصف أنواع الخلايا المحددة؛ فعلى سبيل المثال الخلايا العصبية في خط NBT:DsRed أو الضامة/microglia في خط mpeg1:eGFP. وعلاوة على ذلك، تم تطوير الأجسام المضادة لوصمة عار خلايا معينة، مثل ميكروجليا مع 4 4 الأجسام المضادة.
وهنا يصف لنا عزل الخلايا العصبية والضامة وميكروجليا من العقول الزرد اليرقات. المركزية لهذا البروتوكول تجنب الهضم الأنزيمي الأنسجة في 37 درجة مئوية، ويمكن تعديل التشكيلات الجانبية للهاتف الخلوي. بدلاً من ذلك يتم استخدام نظام ميكانيكي لتجانس الأنسجة في 4 درجات مئوية. ويستتبع هذا البروتوكول تجانس العقول في تعليق خلية، وبهم المناعية تلطيخ وعزل الخلايا العصبية والضامة وميكروجليا بنظام مراقبة الأصول الميدانية. بعد ذلك استخراج الحمض النووي الريبي من تلك الخلايا وتقييم النوعية/كميتها. تمكنا من الحصول على الحمض النووي الريبي ذات جودة عالية (عدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) > 7) لإجراء قبكر على تحليل الضامة/microglia والخلايا العصبية، وترانسكريبتوميك في ميكروجليا. ويمكن هذا النهج أفضل وصف لهذه الخلايا، فضلا عن فهم أوضح حول دورها في التنمية والأمراض.
Introduction
المعرفة في نمو الدماغ وأمراض المخ تحسنت بشكل ملحوظ في العقد الماضي منذ أول التحديد الكمي للماوس الدماغ ترانسكريبتوميس1. والواقع أن تحليل التعبير الجيني واسعة الجينوم يعطينا الوصول للمعلومات الوراثية المفصلة في أنسجة المخ، والخلايا التي يمكن أن تكمل وتحسن الملاحظات مع تقنيات وأدوات أخرى.
الزرد نموذج بيولوجية قوية، سهلة لتولد وتعديلها وراثيا؛ يسمح شفافيته البصرية في مراحل اليرقات الحية التصوير الملاحظات2. لسوء الحظ، بالمقارنة إلى الإنسان والفأر، عدد الأجسام المضادة المتاحة لأداء المناعية تلطيخ منخفضة نوعا. لتصحيح هذا الوضع، مصنوعة خطوط أسماك الزرد المحورة وراثيا بسهولة عن طريق تعديل وراثيا الأسماك للتعبير عن البروتينات الفلورية تحت نوع الخلية المروجين محددة. خطوط الزرد المعدلة وراثيا قد استخدمت في الماضي لدراسة دور الضامة و microglia أثناء تطوير الجهاز العصبي المركزي (CNS) والمرض3،4،،من56. ومع ذلك، فهم تفصيلي لهذه العمليات نحن بحاجة لفهم التغيرات في التعبير الجيني في أنواع الخلايا الخاصة بكل منها. لتحقيق هذا الهدف، قمنا بتطوير أسلوب تجريبي لعزل الخلايا مثل الخلايا العصبية والضامة وميكروجليا من 3 إلى 8 أيام على وجه التحديد العقول الزرد اليرقات بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية). لإنشاء البروتوكول، عملنا مع خطوط الأسماك المحورة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) في الضامة/microglia تحت بلعم-أعرب عن الجينات المروج (mpeg1:eGFP) ودسريد في الخلايا العصبية تحت العصبية ß-tubulin المروج (NBT:DsRed)7،،من89. وعلاوة على ذلك، أجرينا المناعية تلطيخ microglia استخدام 4 4، جسم [مونوكلونل] ماوس على وجه التحديد البقع الزرد microglia10،11. وبعد ذلك يتم استخراج الحمض النووي الريبي (الرنا) من هذه الخلايا لزيادة كمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (qPCR) أو التحليلات الترنسكربيتوم. وقد صمم هذا البروتوكول كفاءة تجانسه أنسجة المخ من اليرقات الزرد؛ جمع الخلايا العصبية والضامة/microglia و microglia دون تغيير لسلامتهم غشاء البلازما، وأخيراً استخراج الحمض النووي الريبي من هذه الخلايا في ذات جودة عالية (رين > 7) والكمية إلى القيام بتحليل الجينوم. خلافا للدراسات المنشورة سابقا أن استخدام العلاج التربسين في 37 درجة مئوية لهضم أنسجة الدماغ12،13، يشجع هذا البروتوكول العمل في 4 درجات مئوية حتى الخطوة استخراج الحمض النووي الريبي للحد من إدخال تعديلات على التشكيل الجانبي التعبير الجيني. تعد هذه الخطوة الحاسمة ك microglia والضامة الخلايا البالغة الحساسية التي تستجيب للتغيرات في بهم المكروية فورا بتغيير تلك الجينات التعبير الشخصية والاستقطاب14،15، 16.
البروتوكول، ووصف هنا بالتفصيل، يظهر عزل الخلايا العصبية والضامة و microglia من الزرد اليرقات العقول، ولكن عمليا، فإنه يمكن تكييفها مع أي خلية أخرى حاليا داخل المخ-أما باستخدام خطوط الأسماك المحورة وراثيا أو المسمى مع الأجسام المضادة المحددة. هذا الأسلوب يتيح وصف أفضل لخلايا الجهاز العصبي المركزي من خلال تحليلاتها التعبير الجيني واسعة الجينوم وسوف تساعد على فهم دورهم خلال التنمية، وأمراض المخ.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويمثل البروتوكول التجريبي الموصوفة هنا طريقة قوية وفعالة لعزل خلايا الدماغ من اليرقات الزرد من 3 إلى 8 إدارة الشرطة الاتحادية. الأهم من ذلك، هذا هو البروتوكول الأول أن يسمح عزل محددة من microglia من العقول الزرد اليرقات. البروتوكول يهدف إلى الحفاظ على سلامة غشاء الخلية، وللتقليل من التعديلات المحتملة لتعبير الجينات التي تحدث أثناء المعالجة. هذه النقطة الأخيرة حاسمة بالنسبة لأهمية النتائج استناداً إلى تحليل تلك الملامح المجينية الخلوية معزولة. في الواقع، تتأثر بشدة الاستقطاب microglia وبلعم المكروية بهم. عند 37 درجة مئوية، أن هذه الخلايا قد تغيرت صورتهم التعبير الجيني في استجابة للظروف التجريبية (رد الضرر (ترانسيكشن)). ولذلك، من المهم إجراء هذه التجربة في 4 درجات مئوية قبل استخراج الحمض النووي الريبي، إلى إبطاء العمليات الخلوية والأنشطة الأيضية. وعلاوة على ذلك، تم اختيار تجانس أنسجة الدماغ الميكانيكية في 4 درجات مئوية بدلاً من الهضم الأنزيمي الأنسجة في 37 درجة مئوية تفادي أي تأثير على التشكيلات الجانبية للتعبير الجيني.
من المهم تسليط الضوء على أن هذا الأسلوب سريع جداً؛ خلال يوم يمكن السكان خلايا الدماغ عدة معزولة من اثنين على الأقل من شروط تجريبية مختلفة وعلى الحمض النووي الريبي المستخرج. الطول الإجمالي للبروتوكول يعتمد على عدد اليرقات تستخدم لكل شرط ترانسيكشن رؤساء اليرقات هو الخطوة تحد (∼ 350 رؤساء/h). وبصفة عامة، للعمل مع ميكروجليا من 3، 5 و 7 إدارة الشرطة الاتحادية يوصي بقطاع ∼ رؤساء 600 كل اختبار للحصول على ما يكفي من الحمض النووي الريبي لاستخراج (الجدول 1). كما ميكروجليا تمثل نوع الخلية مع أدنى العائد (حوالي 112 خلايا الفرد في إدارة الشرطة الاتحادية 7)، يمكن تخفيض عدد رؤساء لأنواع الخلايا الأخرى بما في ذلك الضامة (حوالي 170 خلايا الفرد في إدارة الشرطة الاتحادية 7).
وهناك ميزة أخرى لهذا البروتوكول أنه متى تم إنشاء الإعدادات على فارز نظام مراقبة الأصول الميدانية، يمكن استخدام نفس الإعدادات لتجارب مختلفة. فقد لوحظ أن السكان خلية تناسب تماما من تجربة واحدة إلى أخرى مع بوابات مصممة مسبقاً، تظهر إمكانية تكرار نتائج التجارب باستخدام هذا الأسلوب.
عيوب طفيفة من هذا الأسلوب هو مبلغ منخفض نسبيا من الحمض النووي الريبي التي يتم حصادها. غير هذا القيد أكثر قضية بيولوجية من مسألة تقنية، كما أن عدد microglia منخفض جداً في المراحل المبكرة من نمو الدماغ (الجدول 1). بسبب هذا كمية منخفضة من الحمض النووي الريبي التي تم جمعها، خطوات التضخيم بحاجة إلى النظر إلى القيام بتحليل التعبير الجيني واسعة الجينوم. لحسن الحظ، هذه الخطوات التضخيم إنتاج كميات كافية من كدنا عالية الجودة. وهكذا، يمكن دراسة التغيرات العالمية في ملامح التعبير الجيني الخلايا المعزولة.
وفي الختام، يوفر هذا البروتوكول وسيلة قوية لعزل ودراسة مختلف أنواع الخلايا في الجهاز العصبي المركزي من العقول الزرد اليرقات. يمكن تطبيق هذا على اكتساب فهم أعمق لهذه الخلايا من خلال التنمية، وكذلك فيما يتعلق بدراسة دورها في المرض.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدكتور كلير ديفيز والدكتور فيرونيك ميرون (الملكة معهد الأبحاث الطبية، أدنبرة، المملكة المتحدة) لمساعدة أولية والمناقشات بشأن النهج التجريبي وقمري التدفق الخلوي والخلية الفرز مرفق. وأيد هذا العمل “جائزة إنشاء السرطان بحوث المملكة المتحدة المهنة” للدكتور ديرك الفائزون.
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| D-Glucose | Sigma | G8644-100ML | |
| HBSS 1X | Gibco | 14170-088 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| HBSS 10X | Gibco | 14180-046 | |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Tricaine (MS222) | Sigma | A5040 | |
| Sterilin standard 90mm petri dishes | ThermoFisher | 101VIRR | |
| Surgical micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| 3 mL Pasteur plastic bulk pipette | SLS | PIP4206 | |
| Glass homogenizer | Wheaton | 357538 | |
| Sterilin standard 55mm petri dishes | ThermoFisher | P55V | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 50 ml polypropylen conical tube | Falcon | 352070 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| 10 mL syringe | BD | 302188 | |
| Needle 23G x 1'' | BD | 300800 | |
| Normal goat serum (NGS) | Cell Signalling | 5425S | |
| 35 μm cell strainer cap | BD | 352235 | |
| FACS tubes | BD | 352063 | |
| Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF) | Biolegend | 101321 | |
| Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Anti-4C4 | Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh) | ||
| FACS sorter FACSAria II | BD | QMRI, FACS facility | |
| RNeasy Plus Micro Kit | QIAGEN | 74034 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| QIAshredder | QIAGEN | 79654 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080-051 | |
| LightCycler 96 Real-Time PCR System | Roche | ||
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGEN | 7102-32 | |
| Agilent RNA 6000 Pico reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
References
- Chrast, R., Scott, H. S., et al. The Mouse Brain Transcriptome by SAGE: Differences in Gene Expression between P30 Brains of the Partial Trisomy 16 Mouse Model of Down Syndrome (Ts65Dn) and Normals. Genome Research. 10 (12), 2006-2021 (2000).
- Beis, D., Stainier, D. Y. R. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends in Cell Biology. 16 (2), 105-112 (2006).
- Shiau, C. E., Kaufman, Z., Meireles, A. M., Talbot, W. S. Differential Requirement for irf8 in Formation of Embryonic and Adult Macrophages in Zebrafish. PLoS ONE. 10 (1), 0117513-0117515 (2015).
- Mazaheri, F., Breus, O., et al. Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia. Nature Communications. 5, 1-11 (2014).
- Oosterhof, N., Holtman, I. R., et al. Identification of a conserved and acute neurodegeneration-specific microglial transcriptome in the zebrafish. Glia. 65 (1), 138-149 (2016).
- Hamilton, L., et al. A Zebrafish Live Imaging Model Reveals Differential Responses of Microglia Toward Glioblastoma Cells In Vivo. Zebrafish. , (2016).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. Live Imaging of Neuronal Degradation by Microglia Reveals a Role for v0-ATPase a1 in Phagosomal Fusion In Vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
- Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia. Developmental cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).
- Becker, T., Becker, C. G. Regenerating descending axons preferentially reroute to the gray matter in the presence of a general macrophage/microglial reaction caudal to a spinal transection in adult zebrafish. The Journal of comparative neurology. 433 (1), 131-147 (2001).
- Ohnmacht, J., Yang, Y., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
- Roy-Carson, S., Natukunda, K., et al. Defining the transcriptomic landscape of the developing enteric nervous system and its cellular environment. BMC Genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Khuansuwan, S., Gamse, J. T. Identification of differentially expressed genes during development of the zebrafish pineal complex using RNA sequencing. Developmental biology. 395 (1), 144-153 (2014).
- Schmid, C. D., Melchior, B., et al. Differential gene expression in LPS/IFNγ activated microglia and macrophages: in vitroversus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Tucker, A. F., Collins, H. Y., Mulinyawe, S. B., Barres, B. A. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined- Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Khan, A., Ju, F., et al. Transcriptomic analysis reveals differential activation of microglial genes after ischemic stroke in mice. Neuroscience. 348, 212-227 (2017).
