Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros

1. amostra e preparação de meios de comunicação Prepare o suporte de embrião (E3) pela dissolução de 6,4 mM KCl, 0,22 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2 2 H2O, 0,33 mM MgSO4 7 H2O em H2O. Colete embriões zebrafish imediatamente após a fertilização (0 dpf). Dividi o zebrafish embriões em 50 por prato de petri de 90 mm. Criar embriões a 28,5 ° C em 50 mL de meio de embrião (E3) tratado com 200 µM 1-fenil-2-tioureia (PTU), do final do primeiro dia do desenvolvimento (0 dpf) para a duração do experimento para inibir a pigmentação. Muda o E3 + médio PTU diariamente para a duração do experimento. Tela mpeg1:eGFP e larvas de NBT:DsRed no dpf 2 usando um microscópio fluorescente para a expressão do transgene positivo, macrófagos GFP+ /microglia e DsRed+ neurônios. Preparem-se todos os meios no dia anterior o experimento sob uma capa de cultura de tecidos para evitar a contaminação e, em seguida, armazene-os em 4 ° C. Preparar a mídia A dissolvendo Hepes de 15 mM e 25 mM D-glicose em HBSS 1 x. Prepare o médio gradiente de densidade (100%) misturando 9 volumes do meio de gradiente de densidade de 1 volume de HBSS 10 x. Prepare o suporte de gradiente de densidade (22%) diluindo 22 mL de meio de gradiente de densidade (100%) em 88 mL de DPBS 1 x. Preparar DPBS 1 x. Prepare E3 médio + tricaina misturando E3 médio com 450 μM tricaina. 2. homogeneização Nota: Todas as etapas são realizadas 4 ° C. Adicione 1,5 mL metanosulfonato (15 mM) de 90 mm placas de Petri contendo 50 larvas em 50 mL de meio de embrião E3 tratado com 200 µM PTU para anestesia terminal. Puxa-saco 10 larvas anestesiadas desde os pratos de petri com uma mL 3 pipetas de plástico grosso. Larvas de transferência anestesiada 10 por 10 em uma placa de Petri 55mm repleto de gelada médio de embrião de E3 + tricaina. Sob um estereomicroscópio, alinhe 10 larvas no centro da caixa de Petri. Então transecto larvas cabeças acima o saco vitelino-usando microtesoura cirúrgica (excluir a bexiga natatória para evitar flutuação cabeças). Puxa-saco cabeças desde os pratos de petri com uma mL 3 pipetas de plástico grosso. Espere até que todas as cabeças se reúnem dentro a ponta da pipeta e em seguida, transferi-los para um homogeneizador de vidro contendo 1 mL gelada Media A (transferência em um volume mínimo para reduzir a mídia uma diluição por E3 + tricaina). Manter o homogenizador de vidro no gelo. Use um homogeneizador por condição experimental. Substituir cada pequeno prato de petri contendo gelo frio E3 + tricaina com um novo cada 30 min para assegurar essa transecção é executada no frio E3 + tricaina médio. Substitua o gelado A mídia no homogenizador de vidro quando a cor começa a desvanecer-se.Nota: Diluição de A mídia pode alterar o tecido cabeça devido a mudanças de temperatura. Uma vez que todos os chefes foram coletados (600 cabeças/condição), remover o volume máximo da mídia A partir do homogenizador de vidro e substituí-lo com 1 mL da gelada fresco Media. Perturbar o tecido do cérebro com um homogeneizador de vidro apertado no gelo. Execute 40 rodadas de esmagamento e voltas para larvas de dpf de 3-5 e 50 para larvas de dpf 7 e 8. Adicionar 2 mL da mídia à suspensão de células (1 mL A de mídia / 200 cabeças), que irá diluir as células e reduzir sua aglomeração com mielina para facilitar sua separação durante a centrifugação em gradiente médio de densidade. Para eliminar a aglomeração de célula, execute a suspensão de células através de um filtro de célula de 40 µm colocado em cima de um tubo de Falcão frio 50ml mantido no gelo. Repita esta operação 3 vezes. Transferir 1 mL da suspensão de células para tubos de frio 1,5 mL e girá-los a 300 g por 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante utilizando uma seringa de 10 mL + agulha 23 x 1 ‘. Ressuspender o centrifugado com 1 mL de meio de gradiente gelada 22% densidade levemente sobreposto por 0,5 mL de DPBS gelada 1 x (do não mistura-los, uma interfase entre ambas as soluções serão vistos). Girar os tubos em 950 g sem freio e aceleração lenta por 30 min a 4 ° C.Nota: Este passo separa a mielina de outras células pelo sequestro de no período do intérfase de DPBS 1 x e 22% médio gradiente de densidade, Considerando que células serão sedimento no fundo do tubo. Remoção de mielina é mais eficiente quando a concentração de célula não é muito alta. Usando uma seringa de 10 mL + agulha 23 x 1 ‘ descartar o máximo de DPBS, médio gradiente de densidade e mielina preso na sua interfase. Lavam-se células com 0,5 mL da mídia A + 2% de soro de cabra normal (NGS) e, em seguida, girar tubos a 300 g por 10 min a 4 ° C. Descartar o máximo do líquido sobrenadante e, em seguida, juntar todos os chumbos de célula da mesma condição experimental junto em 1 mL de mídia A + 2% NGS. Se as células de interesse expressam uma proteína fluorescente como macrófagos/microglia de mpeg1:eGFP ou neurônios de NBT:DsRed peixe transgénicos (screening de peixe transgénicos ver 1.1.3), executar a suspensão de células através de um filtro de célula de 35 µm cap e transferi-los para uma tubos de frio 5 mL FACS no gelo, protegidos da luz.Nota: Alternativamente, a imuno-coloração da microglia pode ser executada. 3. Microglia Immuno-coloração Nota: Todas as etapas são executadas a 4 ° C. Ressuspender o centrifugado com 0,3 mL de mídia A + 2% NGS. Dividi-los em tubos de 3 x 1.5 mL: um para células imaculadas medir a autofluorescência de células de interesse, em segundo lugar para o anticorpo secundário (1/200) medir a ligação não-específica do anticorpo secundário para microglia e, terceiro, como um teste (4 4 mouse monoclonal anticorpo (microglia específico) (1/20) + (1/200) de anticorpo secundário). Adicione baixa endotoxina, livre de azida sódica (folha) em 1% para as células (todos os tubos) para bloquear CD16/CD32 interações com o domínio do Fc de imunoglobulinas. Incube as células por 10 min com agitação suave cada 5 min. Adicionar 4 a 4 anticorpo (1/20) para as células (tubo 3) e incube por 30 min com agitação suave a cada 10 min. Girar os tubos a 300 g por 10 min a 4 ° C e, em seguida, descartar o sobrenadante. Lave uma vez com 0,5 mL da mídia A + 2% NGS, então girar tubos a 300 g por 10 min a 4 ° C. Ressuspender o centrifugado com 0,5 ml de mídia A + 2% NGS e incubar as células com folha em 1% por 10 min com agitação suave cada 5 min. Adicione o anticorpo secundário (1/200) para as células (tubo 2 e 3). Incube as células por 30 min com agitação suave cada 10 min e protecção leve. Girar os tubos a 300 g por 10 min a 4 ° C e, em seguida, descartar o sobrenadante. Lave duas vezes com 0,5 mL de mídia A + 2% NGS, então a re-suspender centrifugado com 1 mL de mídia A + 2% NGS. Executar a suspensão de células através de uma tampa de filtro de célula µm 35 e transferi-los para tubos de 5ml frio FACS no gelo, protegido da luz. 4. célula de triagem (FACS) Nota: Executar todas as etapas, a 4 ° C. Classificar os neurônios, macrófagos/microglia e microglia usando um FACS.Nota: Esta etapa é geralmente realizada por um membro do pessoal da instalação de FACS e configurações dependem do tipo de equipamento utilizado. Adicione DAPI em uma concentração de 1 µ g/mL em cada tubo de FACS para rotular as células mortas. Configurar o FACS e tipo de neurônios, macrófagos/microglia ou microglia de todas as células do cérebro. Separar células de detritos em função do seu tamanho e granulosidade e, em seguida, single-células por dispersão para a frente e dispersão do lado da porta. Exclua células mortas por DAPI rotulagem de células vivas. Identifica os neurônios, macrófagos/microglia ou microglia por seus respectivos coloração positiva. Recolher pilhas em tubos de 1,5 mL contendo 1 mL de gelado A mídia + 2% NGS em gelo. Use tubos diferentes para cada tipo de célula. Girar os tubos a 300 g por 10 min a 4 ° C e em seguida, descartar o sobrenadante. Lave uma vez com 0,5 mL de mídia A então descartar o sobrenadante no máximo. 5. extração do RNA Extraia o RNA dos diferentes tipos de células separados por FACS. Para a extração de RNA usar um kit específico e siga as orientações do fabricante. Certifique-se para trabalhar em um ambiente livre de RNase por pipetas com um produto de descontaminação de RNase e limpeza do espaço de trabalho e usar filtro dicas. Recentemente Prepare-se 1 mL de tampão de Lise suplementado com 50 µM β-Mercaptoetanol.Nota: Aqui, β-Mercaptoetanol é adicionado para reduzir a degradação de RNA. Prepare a solução de etanol 70% e 80% usando RNase água livre. Lyse pilhas com 75 µ l de tampão de Lise suplementado com 50 µM β-Mercaptoetanol. Em seguida, use uma máquina trituradora para melhorar o rompimento da pilha. Continue manual de extração de RNA de acordo com o fabricante. No final do protocolo, Eluir o RNA com 14 µ l de água livre de RNase para obter uma concentração suficiente de RNA.