Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

1. örnek ve medyası hazırlama Eriterek KCl 6.4 mM, 0.22 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2 2 H2O, 0,33 mM MgSO4 7 H2O H2o embriyo orta (E3) hazırlayın Zebra balığı embriyo hemen sonra gübreleme (0 dpf) toplamak. Zebra balığı embriyo 50-90 mm petri kabına ayrılmıştır. Embriyo 200 µM 1-fenil 2-Tioüre ile (PTU), tedavi embriyo orta (E3) 50 ml 28.5 ° C’de geliştirme (0 dpf) pigmentasyon etkisizleştirmek için deneme süresi için ilk günün sonundan kaldırın. Değişiklik E3 + PTU orta günlük deneme süresi için. Ekran mpeg1:eGFP ve NBT:DsRed larva 2 dpf floresan stereomicroscope olumlu transgene ifade, GFP+ makrofajlar/microglia ve DsRed+ nöronlar için kullanarak. Tüm medya bir gün önce bir doku kültürü hood kontaminasyon için deneme hazırlamak, sonra onları 4 ° C’de depolayın Medya A 15 mM Hepes ve 25 mM D-glikoz HBSS 1 çözülerek hazırlamak x. Yoğunluk gradient orta (% 100) 9 HBSS 10 1 hacmi yoğunluk gradient ortamda hacimleri karıştırarak hazırlayın x. Yoğunluk gradient orta (% 22) 88 mL DPBS 1 yoğunluk gradient orta (% 100) 22 mL sulandrarak hazırlamak x. Hazırlamak DPBS 1 x. E3 orta + Tricaine 450 mikron ile E3 orta karıştırılarak hazırlamak Tricaine. 2. homojenizasyon Not: Tüm adımlardır: gerçekleştirilen 4 ° C. 1.5 mL Tricaine (15 mM) 90 mm Petri yemekler 200 µM PTU ölümcül onları anestezi ile tedavi E3 embriyo orta 50 ml 50 larva içeren ekleyin. 10 imzalat larvaları üzerinden 3 mL Pasteur plastik toplu pipet ile petri yemekler berbat. Anestezi transfer larva 10 10 55 mm petri kabına içine buz gibi E3 embriyo orta + Tricaine ile dolu. Bir stereomicroscope altında 10 larva petri kabına ortasına hizalayın. O zaman cerrahi mikro-makas (yüzmek kafa yüzen önlemek için mesane hariç) kullanarak sarısı-sac yukarıda larva kafaları transect. Petri yemekler 3 mL Pasteur plastik toplu pipet ile başları berbat. Tüm başkanları pipet ucu içinde toplamak ve sonra 1 mL buz gibi medya A içeren bir cam homogenizer aktarmak kadar bekleyin (medya azaltmak için en az bir bölüm bir seyreltme transferi E3 + Tricaine tarafından). Cam homogenizer buz üzerinde tutun. Deneysel koşul başına bir homogenizer kullanın. Her küçük petri kabına buz içeren yerine soğuk E3 + Tricaine ile yeni bir tane her 30 dakikada o transeksiyon sağlamak için gerçekleştirilen soğuk E3 + Tricaine orta. Renk solmaya başladığında cam homogenizer buz gibi medya A değiştirin.Not: Medya A seyreltme sıcaklık değişiklikleri nedeniyle kafa doku değiştirebilirsiniz. Tüm başkanları topladıktan sonra (600 başkanları/koşul), medya a maksimum ses cam homogenizer kaldırın ve eski yerine koymak o ile 1 mL taze buz gibi medya a. Buz üzerinde sıkı cam homogenizer ile beyin dokusu bozabilir. 3-5 dpf larva ve 7 ve 8 dpf larva için 50 için 40 mermi ezme ve döner gerçekleştirin. Hücre süspansiyon için medya a 2 mL ekleyin (1 mL medya A / 200 başları), bu seyreltik hücreleri ve onların Aglomerasyon ile ayırma Santrifüjü yoğunluk gradient orta sırasında kolaylaştırmak için miyelin azaltmak. Hücre Aglomerasyon ortadan kaldırmak için hücre süspansiyon buzda muhafaza soğuk 50 mL Şahin tüp üzerine yerleştirilen bir 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla çalıştırın. Bu işlem 3 kez tekrarlayın. Hücre süspansiyon 1 mL soğuk 1.5 mL tüpler içine aktarmak ve onları 4 ° C’de 10 dakika için 300 g de spin 10 mL şırınga kullanarak süpernatant kaldırmak + 23G x 1” iğne. Hücre Pelet yavaşça buz gibi DPBS 1 tarafından 0.5 mL overlaid buz gibi % 22 yoğunluğu degrade orta 1 mL ile yeniden askıya alma (yapmak değil onları her iki çözüm arasında bir interfaz görülebilir mix) x. Tüpler, 950 g 4 ° C’de 30 dk için yavaş hızlanma ve fren olmadan spinNot: Bu adımı DPBS 1 interfaz iyon tarafından miyelin diğer hücrelerden ayırır x ve % 22 yoğunluk gradient orta, hücreleri tüp alt kısmında cips oysa. Hücre konsantrasyonu çok yüksek olduğunda miyelin kaldırma daha verimli olur. Bir 10 mL şırınga + en çok DPBS, yoğunluk gradient orta ve miyelin tuzağa iğne 23G x 1” atma onların Interphase kullanarak. Hücreleri medya a 0.5 mL + normal keçi serum (NGS) % 2’si ile yıkayın, sonra tüpler, 300 g 4 ° C’de 10 dakika için spin En fazla süpernatant atmak, sonra aynı deneysel koşullarda 1 mL birlikte medya A + %2 tüm hücre çökeltilerini havuz NGS. Faiz hücreleri makrofajlar/microglia mpeg1:eGFP dan gibi floresan bir protein hızlı veya NBT:DsRed transgenik balık (transgenik balık bkz: 1.1.3 tarama), hücre süspansiyon 35 µm hücre süzgeç aracılığıyla çalıştırmak neurons kap ve içine aktarmak bir buz, üzerine soğuk 5 mL FACS boruları ışıktan korunan.Not: Alternatif olarak, microglia, immün boyama gerçekleştirilebilir. 3. Microglia immün boyama Not: Tüm adımlar 4 ° C’de gerçekleştirilir Hücre Pelet medya A + %2 0.3 mL ile yeniden askıya NGS. 3 x 1.5 mL tüplerde bölüp: bir ikincil antikor microglia ve üçüncü bir test olarak non-spesifik bağlama ölçmek ikincil antikor (1/200) için auto-floresan hücreleri ilgi, ikinci ölçmenin günahı hücreler için (4 c 4 fare monoklonal antikor (microglia özel) (1/20) + ikincil antikor (1/200)). Düşük endotoksin, azid ücretsiz (Fc etki alanı ile CD16/CD32 etkileşimleri immünglobulin engellemek için yaprak) %1 hücrelere (tüm tüpler) ekleyin. Hücreler ile nazik ajitasyon her 5 dk 10 min için kuluçkaya. 4 c 4 ekleyin antikor (1/20) hücrelere (tüp 3) ve nazik ajitasyon ile 30 dk için her 10 min kuluçkaya. Tüpler, 300 g 4 ° C’de 10 dakika için spin sonra süpernatant atmak. Medya a + %2 0.5 mL ile NGS, sonra spin sonra tüpler 300 g 4 ° C’de 10 dakika için yıkama Yeniden askıya hücre Pelet medya A + %2 0.5 ml ile NGS ve nazik ajitasyon her 5 dk ile 10 min için % 1 yaprak hücreleri kuluçkaya. İkincil antikor (1/200) hücreleri (tüp 2 ve 3) ekleyin. Hücreler için nazik ajitasyon ile 30 dk her 10 min ve lamba koruma kuluçkaya. Tüpler, 300 g 4 ° C’de 10 dakika için spin sonra süpernatant atmak. Medya A + %2 NGS sonra yeniden askıya hücre Pelet 0.5 mL ile medya A + %2 1 mL ile iki kez yıkama NGS. Hücre süspansiyon bir 35 µm hücre süzgeç kap çalıştırmak ve ışıktan korunan buzda soğuk 5 mL FACS tüpler içine aktarabilirsiniz. 4. hücre (FACS) sıralama Not: 4 ° C’de tüm adımları gerçekleştirin Nöronlar, makrofajlar/microglia ve microglia bir FACS kullanarak sıralayın.Not: Bu adım genellikle FACS tesis personel tarafından gerçekleştirilir ve ayarları cihazları türüne göre değişir. 1 µg/mL olan ölü hücreleri etiketlemek için her FACS tüpünde bir konsantrasyon, DAPI ekleyin. FACS ve sıralama nöronlar, makrofajlar/microglia veya microglia tüm beyin hücrelerinden ayarlamanız. Hücre boyutu ve parçalı yapı işlevindeki enkaz ayırmak, o zaman tek-hücreleri tarafından ileri dağılım ve yan dağılım kapısı. Ölü hücreleri canlı hücrelerden DAPI etiketleme tarafından hariç. Nöronlar, makrofajlar/microglia veya microglia onların anılan sıraya göre olumlu boyama tarafından tanımlamak. 1.5 mL tüpler buz gibi medya A + %2 1 mL içeren hücrelerde toplamak NGS buz üzerinde. Farklı tüpler her hücre türü için kullanın. Tüpler, 300 g 4 ° C’de 10 dakika için spin ve süpernatant atın. Medya 0.5 mL ile A sonra atmak sonra en fazla süpernatant yıkayın. 5. RNA çıkarma RNA FACS tarafından ayrılmış farklı hücre tipleri ayıklayın. RNA çıkarılması için belirli bir setini kullanın ve üreticinin yönergeleri izleyin. Temizlik çalışma alanı ve Pipetler RNase dekontaminasyon ürün ile bir RNase özgür ortamda çalışmak ve filtre ipuçları kullanmak için emin olun. Taze 1 mL 50 µM β-mercaptoethanol ile desteklenmiş lizis arabelleği hazırlayın.Not: Burada, β-mercaptoethanol RNA bozulması azaltmak için eklenir. RNase kullanarak % 70 ve % 80 etanol çözüm ücretsiz su hazırlamak. 75 µL 50 µM β-mercaptoethanol ile desteklenmiş lizis arabelleği içeren hücreleri parçalayıcı. Daha sonra bir kağıt öğütücü hücre bozulma geliştirmek için kullanın. RNA ayıklama üretici göre el ile devam edin. Protokol sonunda yeterli bir RNA konsantrasyon elde etmek için RNA 14 µL RNase free su ile elute.