分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

1. サンプルとメディアの準備 6.4 mM KCl、0.22 mM の NaCl、0.33 mM CaCl2 2 H2O、0.33 mM MgSO4 7 H2O H2o. を溶解することにより胚メディア (E3) の準備します。 受精 (0 dpf) の直後にゼブラフィッシュ胚を収集します。 90 mm シャーレあたり 50 にゼブラフィッシュの胚を分割します。開発 (0 dpf) 色素沈着を抑制する実験の期間の最初の日の終わりから胚胚中 (E3) 200 μ M 1-フェニル-2-チオ尿素 (PTU) で治療の 50 ml 28.5 ° c を上げます。 変更、E3 + PTU 媒体毎日実験の持続期間のため。 画面 mpeg1:eGFP と蛍光顕微鏡を用いた遺伝子発現の肯定的な GFP+マクロファージ/ミクログリアとした DsRed+ニューロン 2 dpf で NBT:DsRed 幼虫。 すべてのメディアの汚染を避けるためにティッシュ文化フードの下で実験の前に一日を準備し、4 ° C で保存 15 mM Hepes と 25 mM グルコース HBSS 1 を溶解することによりメディア A の準備 x。 密度勾配 HBSS 10 の 1 ボリューム中の 9 つの容積を混合することによって密度勾配媒体 (100%) を準備 x。 密度勾配媒体 (100%) の 22 mL DPBS 1 の 88 mL で希釈することによって密度勾配媒体 (22%) を準備 x。 準備 DPBS 1 x。 450 μ M と E3 媒体を混合して E3 媒体 + Tricaine を準備 Tricaine。 2. 均質化 注:すべての手順が実行される 4 ° C です。 200 μ M 末期それらを麻酔する PTU で治療 E3 胚中の 50 mL の 50 の幼虫を含む 90 mm シャーレに 1.5 mL Tricaine (15 mM) を追加します。 3 ml のプラスチック製バルクのパスツール ピペット シャーレから 10 麻酔幼虫を吸います。 伝達麻酔幼虫 55 mm のペトリ皿に 10 の 10 は、冷たい E3 胚中 + Tricaine でいっぱい。 、顕微鏡下でペトリ皿の中心 10 幼虫に合わせます。その後、トランセクト卵黄嚢の外科マイクロはさみ (フローティング ヘッドを避けるために浮袋を除く) を使用して上記の幼虫の頭。 3 ml のプラスチック製バルクのパスツール ピペット シャーレから頭を吸います。すべてのヘッド ピペット チップ内で収集し、1 mL 冷たいメディア A を含んでいるガラス ホモジナイザーに転送まで待つ (メディアを抑える最小限のボリュームで希釈して転送 E3 + Tricaine)。氷の上のガラスのホモジェナイザーを維持します。実験条件ごとの 1 つのホモジナイザーを使用します。 氷が入っている各小さいペトリ皿を置き換える冷たい E3 + Tricaine 冷たい E3 + Tricaine で新しいものとその断裂を確保するために 30 分ごとを実行中。 色が退色を起動時ガラス ホモジナイザの冷たいメディア A を取り付けます。注:メディアの希釈は、温度変化による頭部の組織を変更できます。 (600 頭/条件)、ガラスのホモジェナイザーからメディア A の最大ボリュームを削除し、1 ml の新鮮な冷たいメディア A の交換のすべてのヘッドが収集された後 氷の上タイトなガラス ホモジナイザーを用いた脳組織を混乱させます。3-5 dpf 幼虫と 7 と 8 の dpf 幼虫 50 の 40 回のラウンドを粉砕し、回転を実行します。 細胞懸濁液にメディア A 2 mL を追加 (1 mL メディア A/200 頭)、それは細胞を希釈し、密度勾配媒体の遠心分離の間に彼らの分離を容易にするミエリンとその凝集を低減します。 細胞の集積を避けるためには、氷の上を維持 50 mL の冷たいファイティングファルコン管の上に配置された 40 μ m 携帯こし器を通って細胞懸濁液を実行します。この操作を 3 回繰り返します。 冷たい 1.5 mL チューブに細胞懸濁液の 1 mL を移すし、4 ° c. で 10 分の 300 g でそれらをスピン 10 mL のシリンジを使用して上清を除去 + 針 23 x 1」。 優しく冷たい DPBS 1 の 0.5 mL でオーバーレイ冷たい 22% の密度勾配媒体の 1 mL の細胞ペレットを再停止 (は見られるそれらは、両方のソリューションの間中間期) x。 スピンで 950 g ブレーキと 4 ° C で 30 分間低速加速なしチューブ注:この手順は DPBS 1 の相間で貯留することで他のセルからの髄を分離 x と 22% 密度勾配媒体、細胞が管の底にペレットに対し。髄鞘の除去は、細胞濃度が高すぎるではない場合に効率的です。 相間で 10 mL のシリンジ + 最大 DPBS、密度勾配媒体および髄鞘が閉じ込められた針 23 × 1 ‘ 破棄を使用します。 メディア A 0.5 mL + ヤギ血清 (NGS) の 2% 血球を洗浄し、スピンで 4 ° C で 10 分間 300 g チューブ 培養上清の最大値を破棄し、プールのメディア A + 2 %1 mL で一緒に同一の実験条件からすべての細胞ペレット NGS。 興味のセル表現 mpeg1:eGFP からマクロファージ/ミクログリアのような蛍光蛋白質、または NBT:DsRed 遺伝子導入魚 (遺伝子導入魚を参照してください 1.1.3 のスクリーニング)、35 μ m 携帯こし器を通って細胞懸濁液を実行からニューロン キャップしにそれらを転送します。光から保護されている氷の上の冷たい 5 mL FACS 管。注:また、ミクログリアの免疫染色を実行できます。 3. ミクログリア免疫染色 注:4 ° C ですべての手順を実行します。 メディア + 2% の 0.3 ml 細胞ペレットを再停止 NGS。3 × 1.5 mL チューブにそれらを分割: 無染色細胞ミクログリアと第 3 テストの二次抗体の非特異的結合を測定する二次抗体 (1/200) の第二に興味のセルから自動蛍光を測定するための 1 つ (4 4 マウス モノクローナル抗体 (ミクログリア特定) (1/20) + 二次抗体 (1/200))。 低エンドトキシン、アジ化無料 (リーフ) 細胞 (すべての管) に 1% で免疫グロブリンの Fc ドメイン CD16/CD32 相互作用をブロックするを追加します。穏やかな攪拌 5 分ごとに 10 分のセルを孵化させなさい。 4 4 を追加抗体 (1/20) (管 3) のセルに 10 分毎穏やかな撹拌で 30 分間インキュベートし、。 4 ° C で 10 分の 300 g でチューブをスピンし、上澄みを廃棄します。 メディア A + 2 %0.5 mL と NGS、それからスピン チューブ 4 ° c. で 10 分の 300 g で一度洗う メディア + 2% の 0.5 ml の細胞ペレットの再停止 NGS と穏やかな攪拌 5 分ごとに 10 分間の 1% で葉の細胞を孵化させなさい。 二次抗体 (1/200) を (2 と 3 の管) のセルに追加します。すべての 10 分と軽い保護は、穏やかな攪拌と 30 分のための細胞を孵化させなさい。 4 ° C で 10 分の 300 g でチューブをスピンし、上澄みを廃棄します。 メディア + 2 %1 mL でメディア A + 2 %ngs、細胞ペレットの再停止の 0.5 mL で 2 回洗浄 NGS。 35 μ m の細胞のストレーナー キャップを介して細胞懸濁液を実行し、氷、光から保護に冷たい 5 mL FACS の管にそれらを転送します。 4. セル (FACS) を並べ替え 注:4 ° C ですべての手順を実行します 神経細胞、マクロファージ/ミクログリアおよび、FACS を用いたミクログリアを並べ替えます。注:この手順は通常 FACS 施設のスタッフ メンバーが実行し、使用機器の種類に依存する設定。 死んだ細胞をラベルする各 FACS 管で 1 μ G/ml の濃度の DAPI を追加します。 すべての脳細胞の FACS と並べ替えの神経細胞、マクロファージ/ミクログリアやミクログリアを設定します。破片のサイズと細かさで、関数の中から細胞を分離し、前方散乱、側方散乱による単一細胞のゲートします。DAPI は生きた細胞からラベリングによって死んだ細胞を除外します。彼らのそれぞれ肯定的な染色による神経細胞やマクロファージ/ミクログリア ミクログリアを識別します。 冷たいメディア + 2 %1 mL を含む 1.5 mL チューブに細胞を収集 NGS 氷の上。セル タイプごとに別のチューブを使用します。 スピンで 4 ° C で 10 分間 300 g チューブと、上澄みを廃棄します。 メディアの 0.5 mL とし、破棄上清の最大一度洗ってください。 5. RNA の抽出 FACS で区切られた異なった細胞のタイプから RNA を抽出します。RNA の抽出特定のキットを使用し、製造元のガイドラインに従ってください。クリーニング ワークスペースと RNase 除染製品、ピペットによる RNase フリー環境で動作して、フィルターのヒントを確認します。 たて 50 μ M β-メルカプトエタノールを添加した換散バッファーの 1 つの mL を準備します。注:ここでは、RNA の劣化を抑える β-メルカプトエタノールが追加されます。 無料水 RNase を使用して 70% と 80% のエタノール溶液を準備します。 50 μ M β-メルカプトエタノールを添加した換散バッファーの 75 μ L で細胞を溶解させます。セル中断を改善するためにシュレッダーを使用しています。 取扱説明書メーカーによると RNA の抽出を続行します。 プロトコルの最後で、RNA 濃度が十分な RNase 自由水の 14 μ L の RNA を溶出します。