Isolamento e l'estrazione di RNA dei neuroni, macrofagi e Microglia da cervelli di Zebrafish larvale

1. campione e preparazione di terreni Preparare il supporto di embrione (E3) sciogliendo 6,4 mM KCl, 0,22 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2 2 H2O, 0,33 mM MgSO4 7 H2O H2O. Raccogliere gli embrioni di zebrafish immediatamente dopo la fecondazione (0 dpf). Dividere gli embrioni di zebrafish in 50 a capsula di petri di 90 mm. Sollevare gli embrioni a 28,5 ° C in 50 mL di mezzo di embrione (E3) trattati con 200 µM 1-fenil 2-tiourea (PTU), dalla fine del primo giorno di sviluppo (0 dpf) per tutta la durata dell’esperimento per inibire la pigmentazione. Cambia l’E3 + PTU medio giornaliero per tutta la durata dell’esperimento. Schermo mpeg1:eGFP e larve di NBT:DsRed al dpf 2 utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente per l’espressione del transgene positivo, macrofagi GFP+ /microglia e DsRed+ i neuroni. Preparare tutti i media il giorno prima dell’esperimento sotto una cappa di coltura del tessuto per evitare la contaminazione, quindi conservarli a 4 ° C. Preparare i supporti A sciogliendo 15 mM Hepes e 25 mM D-glucosio in HBSS 1 x. Preparare mezzo gradiente di densità (100%) con 9 volumi del mezzo gradiente di densità in 1 volume di HBSS 10 x. Preparare il supporto di gradiente di densità (22%) diluendo 22 mL di terreno gradiente di densità (100%) in 88 mL di DPBS 1 x. Preparare DPBS 1 x. Preparare il medium E3 + tricaina mescolando E3 media con 450 μM tricaina. 2. omogeneizzazione Nota: Tutti i passaggi sono eseguiti 4 ° C. Aggiungere 1,5 mL tricaina (15 mM) contenente 50 larve in 50 mL di mezzo di embrione E3 trattati con 200 µM PTU per anestetizzare terminalmente li di Petri di 90 mm. Aspirare 10 larve anestetizzate dalle capsule di Petri con una pipetta Pasteur massa plastica da 3 mL. Trasferimento anestetizzato larve 10 per 10 in una capsula di Petri 55mm riempito con gelida E3 embrione medium + tricaina. Sotto un microscopio stereoscopico, allineano 10 larve al centro del piatto petri. Quindi transetto larvale teste sopra il vitellino utilizzando micro-forbici chirurgiche (escludere la vescica natatoria per evitare teste di galleggiamento). Aspirare con teste dalle capsule di Petri con una pipetta Pasteur massa plastica da 3 mL. Attendere fino a quando tutte le teste si riuniscono all’interno la punta della pipetta e poi trasferiscono in un omogeneizzatore di vetro contenenti 1 mL ghiacciata Media A (trasferimento in un volume minimo di ridurre Media una diluizione in E3 + tricaina). Mantenere l’omogeneizzatore di vetro sul ghiaccio. Utilizzare un omogeneizzatore a condizione sperimentale. Sostituire ogni piccolo piatto di petri contenente ghiaccio freddo E3 + tricaina con uno nuovo ogni 30 min per assicurare che il transection viene eseguita a freddo E3 + tricaina medio. Sostituire la gelida A Media nell’omogeneizzatore di vetro quando il colore inizia dissolvenza.Nota: Diluizione A media può alterare il tessuto testa a causa di sbalzi di temperatura. Una volta che tutte le teste sono stati raccolti (600 capi/condizione), togliere il volume massimo di supporto all’omogeneizzatore di vetro e sostituirlo con 1 mL della ghiacciata a Media fresco. Distruggere il tessuto di cervello con un omogeneizzatore di vetro stretto sul ghiaccio. Eseguire 40 giri di frantumazione e giri per 3-5 dpf larve e 50 per le larve di dpf 7 e 8. Aggiungere 2 mL di supporto A sospensione cellulare (1 mL di supporto A / 200 capi), che in grado di diluire le cellule e ridurre la loro agglomerazione con mielina per facilitare la loro separazione durante la centrifugazione in gradiente medio densità. Per eliminare agglomerazione di cella, è possibile eseguire la sospensione cellulare attraverso un colino di cella di 40 µm posizionato sopra un tubo falcon freddo 50ml mantenuto sul ghiaccio. Ripetere questa operazione 3 volte. Trasferire 1 mL di sospensione cellulare in provette da 1,5 mL freddo e li spin a 300 g per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante usando una siringa da 10 mL + ago 23 x 1 ‘. Risospendere il pellet cellulare con 1 mL di 22% densità ghiacciata terreno sfumatura delicatamente overlaid da 0,5 mL di DPBS ghiacciata 1 x (do non mix loro, un’interfase tra entrambe le soluzioni saranno visibili). Girare le provette a 950 g senza freno e lenta accelerazione per 30 min a 4 ° C.Nota: Questo passaggio separa mielina da altre cellule sequestrando esso all’interfase di DPBS 1 x e 22% densità gradiente medio, considerando che le cellule saranno a pellet nella parte inferiore del tubo. Rimozione di mielina è più efficiente quando la concentrazione delle cellule non è troppo alto. Usando una siringa da 10 mL + ago 23 x 1 ‘ scartare il massimo di DPBS, densità gradiente medio e mielina intrappolato al loro interfase. Lavare le cellule con 0,5 mL di mezzi A + 2% di siero di capra normale (NGS), poi fai girare tubi a 300 g per 10 min a 4 ° C. Scartare il massimo del surnatante, poi piscina tutte le palline delle cellule dalla stessa condizione sperimentale insieme in 1 mL di Media A + 2% NGS. Se le cellule di interesse esprimono una proteina fluorescente come macrofagi/microglia da mpeg1:eGFP o neuroni dai pesci transgenici NBT:DsRed (proiezione di pesci transgenici Vedi 1.1.3), eseguire la sospensione cellulare attraverso un colino di cella 35 µm di cap e trasferirli in un tubi freddi 5ml FACS su ghiaccio, al riparo dalla luce.Nota: In alternativa, può essere eseguita la immunocolorazione della microglia. 3. Microglia Immuno-colorazione Nota: Tutti i passaggi sono eseguiti a 4 ° C. Risospendere il pellet cellulare con 0,3 mL di Media A + 2% NGS. Dividerli in tubi 3 x 1,5 mL: uno per le celle non colorate su misura auto-fluorescenza da celle di interesse, in secondo luogo per l’anticorpo secondario (1/200) misurare il legame non specifico dell’anticorpo secondario di microglia e terzo come test (4 4 mouse monoclonale anticorpo (microglia specifica) (1/20) + anticorpo secondario (1/200)). Aggiungere basso endotossina, privo di Azide (foglia) all’1% delle cellule (tutti i tubi) per bloccare CD16/CD32 interazioni con il dominio Fc delle immunoglobuline. Incubare le cellule per 10 min con movimentazione delicata ogni 5 min. Aggiungere i 4 4 anticorpo (1/20) alle cellule (tubo 3) ed incubare per 30 min con agitazione delicata ogni 10 min. Girare i tubi a 300 g per 10 min a 4 ° C, quindi scartare il surnatante. Lavare una volta con 0,5 mL di mezzi A + 2% NGS, poi girare le provette a 300 g per 10 min a 4 ° C. Pellet e risospendere con 0,5 ml di Media A + 2% NGS e incubare le cellule con foglia all’1% per 10 minuti con agitazione delicata ogni 5 min. Aggiungere anticorpo secondario (1/200) alle celle (filmato 2 e 3). Incubare le cellule per 30 min con agitazione delicata ogni 10 min e protezione dalla luce. Gira tubi a 300 g per 10 min a 4 ° C, quindi eliminare il surnatante. Lavare due volte con 0,5 mL di mezzi A + 2% NGS, poi pellet e risospendere con 1 mL di Media A + 2% NGS. Eseguire la sospensione cellulare attraverso un tappo di colino di 35 µm cellulare e trasferirli in provetta freddo 5 mL FACS su ghiaccio, al riparo dalla luce. 4. cell Sorting (FACS) Nota: Eseguire tutti i passaggi a 4 ° C. Ordinare i neuroni, microglia/macrofagi e microglia utilizzando un FACS.Nota: Questa operazione viene solitamente eseguita da un membro del personale della struttura FACS e impostazioni dipendono dal tipo di attrezzatura utilizzata. Aggiungere DAPI ad una concentrazione di 1 µ g/mL in ciascun tubo di FACS per etichettare le cellule morte. Impostare FACS e sorta di neuroni, microglia/macrofagi o microglia da tutte le cellule del cervello. Celle separate dai detriti in funzione della loro dimensione e granularità, quindi cancello singolo-cellule di forward scatter e dispersione laterale. Escludere le cellule morte di DAPI etichettatura da cellule vive. Identificare i neuroni, microglia/macrofagi o microglia dalla loro rispettiva macchiatura positiva. Raccogliere le cellule in provette da 1,5 mL contenente 1 mL di gelida Media A + 2% NGS su ghiaccio. Utilizzare tubi diversi per ogni tipo di cellula. Gira tubi a 300 g per 10 min a 4 ° C e quindi scartare il surnatante. Lavare una volta con 0,5 mL di Media un allora scartare il massimo del surnatante. 5. estrazione del RNA Estrarre RNA dai tipi differenti delle cellule separati da FACS. Estrazione del RNA utilizzare un kit specifico e attenersi alle indicazioni del produttore. Garantire per lavorare in un ambiente privo di RNAsi di pulizia dell’area di lavoro e le pipette con un prodotto di decontaminazione di RNAsi e utilizzare puntali con filtro. Appena preparare 1 mL di tampone di lisi completati con 50 µM β-mercaptoetanolo.Nota: Qui, β-mercaptoetanolo è aggiunto per ridurre la degradazione del RNA. Preparare la soluzione di etanolo 70% e 80% utilizzando RNasi acqua gratuita. Lisare cellule con 75 µ l di tampone di lisi completati con 50 µM β-mercaptoetanolo. Quindi utilizzare un trituratore per migliorare la distruzione cellulare. Continuare manuale dell’estrazione di RNA secondo produttore. Alla fine del protocollo, eluire il RNA con 14 µ l di acqua libera RNasi per ottenere una sufficiente concentrazione di RNA.