Medición de consumo de oxígeno mitocondrial en las fibras Permeabilized de Drosophila utilizando cantidades mínimas de tejido
Summary
En este artículo se describe un método para medir el consumo de oxígeno mediante respirometría de alta resolución de tórax permeabilized de Drosophila. Esta técnica requiere una cantidad mínima de tejido en comparación con la técnica de aislamiento mitocondrial clásica y los resultados obtenidos son más fisiológicamente relevantes.
Abstract
La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, representa un modelo emergente para el estudio del metabolismo. De hecho, drosophila tienen estructuras homólogas a los órganos humanos poseen rutas metabólicas altamente conservados y tienen una vida útil relativamente corta que permite el estudio de los mecanismos fundamentales diferentes en un período corto de tiempo. Sin embargo, es sorprendente que uno de los mecanismos esenciales para el metabolismo celular, la respiración mitocondrial, no ha sido bien investigada en este modelo. Es probable porque la medida de la respiración mitocondrial en Drosophila requiere generalmente un gran número de personas y los resultados obtenidos no son altamente reproducibles. Aquí, se describe un método que permite la medición precisa del consumo de oxígeno mitocondrial utilizando cantidades mínimas de tejido de Drosophila. En este método, los tórax son disecados y permeabilized mecánicamente con pinzas afiladas y químicamente con saponina, permitiendo que diferentes compuestos cruzar la membrana celular y modular la respiración mitocondrial. Después de permeabilización, se realiza un protocolo para evaluar la capacidad de los diferentes complejos del sistema de transporte de electrones (ETS) para la oxidación de diferentes sustratos, así como su respuesta a un uncoupler y varios inhibidores. Este método presenta muchas ventajas comparados aislamientos mitocondriales, ya que es más fisiológico relevante porque la mitocondria todavía está interactuando con los otros componentes celulares y la morfología mitocondrial se conserva. Además, preparaciones de la muestra son más rápidas, y los resultados obtenidos son altamente reproducibles. Combinando las ventajas de la Drosophila como modelo para el estudio del metabolismo con la evaluación de la respiración mitocondrial, importante nueva información puede ser revelada, sobre todo cuando las moscas están experimentando diferentes ambientales o fisiopatológico condiciones.
Introduction
La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, se ha utilizado como organismo modelo para la investigación genética para sobre un siglo1. El estudio de este organismo no sólo ha conducido a importantes conocimientos fundamentales sobre herencia ligada al sexo2, mutación tarifa3, el desarrollo del sistema de los nervios y la celda destino determinación4, pero recientemente también se ha convertido en un herramienta valiosa para estudiar los mecanismos inherentes a varias enfermedades tales como Alzheimer y Parkinson5,6. Por otra parte, es un modelo popular para estudiar el proceso de envejecimiento, ya que se pueden levantar en gran número en un período corto de tiempo y tienen una vida corta. También poseen estructuras homólogas a los órganos humanos, como un corazón, cuerpos grasos (funciona de manera similar como el tejido adiposo hígado y blanco), oenocytes (células similares a hepatocitos), células (equivalentes a las células β-pancreáticas), productoras de insulina, así como la hemolinfa transporta metabolitos (análogo a la sangre de vertebrados)7. Además, las vías centrales del metabolismo intermediario (incluyendo la vía de señalización insulina/insulina-como factor de crecimiento similar y vías del blanco de rapamicina-TOR) son también altamente conservado7. Por estas razones, Drosophila han explotado recientemente para describir los mecanismos fundamentales que controlan el metabolismo, especialmente en condiciones patológicas inherentes a humanas enfermedades metabólicas como diabetes8. Un componente importante del metabolismo es la mitocondria que integra múltiples vías y realiza una de las funciones biológicas más importantes de la vida, la producción de ATP, mediante el proceso de fosforilación oxidativa (OXPHOS). Teniendo en cuenta su papel central en el metabolismo del organismo, no es de extrañar que las disfunciones mitocondriales están implicadas en muchas enfermedades como enfermedad de Parkinson9 y enfermedad de Alzheimer enfermedades10, así como en la esclerosis lateral amiotrófica 11 , 12. también son determinantes fundamentales del proceso de envejecimiento. De hecho, son los principales productores de especies reactivas del oxígeno (ROS) en la célula, que puede ser perjudicial para la célula en alta concentración a través del daño oxidativo11. Envejecimiento también se ha asociado a la acumulación de mutados o dañados del ADN mitocondrial13, mitofagia disfunciones14,15 , así como alteración de la Biogénesis mitocondrial16. Las mitocondrias también son determinantes de la homeostasis de la célula pueden utilizar diferentes sustratos para ajustar varias funciones celulares según la abundancia o escasez de macronutrientes17,18.
De hecho, los diferentes nutrientes en la dieta (carbohidratos, lípidos y proteínas) son digeridos, absorbidos y transportados en las células. Luego se transforman en el citosol y los substratos derivados son transportados a la matriz mitocondrial donde se producen reduciendo equivalentes, tales como NADH y FADH219. Estos equivalentes reductores son oxidados luego por diferentes complejos enzimáticos del sistema de transporte de electrones (ETS). Estos complejos están incrustados en la membrana interna mitocondrial, como el complejo I y complejo II. Además, otros complejos enzimáticos como el glicerol-3-fosfato deshidrogenasa mitocondrial y la deshidrogenasa de prolina representan rutas alternativas para la entrada de electrones en la ETS20,21. Estos complejos ‘alternativos’ son particularmente importantes en los insectos, como según la especie, pueden participar activamente para aumentar la respiración20,22,23,21. Electrones de estas ETS sistemas de alimentación se transfieren a la ubiquinona y posteriormente al complejo III y luego al complejo IV, hasta el aceptor final, oxígeno molecular. Esta transferencia de electrones genera una fuerza protón-motriz a través de la membrana interna mitocondrial conduce a la fosforilación de ADP a ATP en el complejo V (figura 1). Teniendo en cuenta el papel central de la mitocondria en la homeostasis de la célula, estudiando el metabolismo mitocondrial utilizando el modelo relevante D. melanogaster representa una poderosa herramienta para delinear los mecanismos subyacentes de diversos fisiopatológicos condiciones o bajo estrés celulares y medio ambiente. Sorprendentemente sin embargo, sólo un puñado de estudios realmente mide la respiración mitocondrial en Drosophila24,25,26. De hecho, experimentos con el objetivo de evaluar el consumo de oxígeno mitocondrial requieren el aislamiento de las mitocondrias. Aunque ventajosa para la medición de funciones mitocondriales (como producción de ROS o relación P/O como marcador de la eficiencia mitocondrial27,28), estos aislamientos generalmente requieren grandes cantidades de tejido de varios individuos24,29. Este requisito para grandes cantidades de tejido y de los individuos es un factor limitante importante, teniendo en cuenta que todos los individuos deben ser la misma edad y preferiblemente del mismo sexo para los experimentos, haciendo la medida de la respiración en diferentes tiempo puntos laborioso en el mejor. Por otra parte, mientras que aislamientos mitocondriales pueden proporcionar la penetración importante en los mecanismos fundamentales que rigen el metabolismo mitocondrial, los métodos utilizados para aislar mitocondrias tienen varios inconvenientes como la dificultad para obtener resultados reproducibles , interrupción de la red mitocondrial y alteración de mitochondrial estructura y función de29,30,31.
El objetivo de este estudio es presentar un protocolo robusto para medir consumo de oxígeno mitocondrial en Drosophila utilizando sólo una cantidad mínima de tejido a partir de muy pocos individuos. Este protocolo consiste en la medición de oxígeno mitocondrial consumo en situ con fibras musculares permeabilized29 de tórax de Drosophila en combinación con alta resolución respirometria32,33, 34 , 35. este método tiene también ventajas adicionales en comparación con el método clásico de aislamiento mitocondrial puesto que las interacciones con los otros componentes de la célula como estructura y la función mitocondrial así como más se conservan en permeabilized las fibras29,31,,36, que hace que este enfoque más fisiológico relevantes. Con este protocolo, funciones mitocondriales pueden evaluarse con precisión con alta resolución respirometría en tórax solamente tres de Drosophila, sustratos permitiendo la determinación del consumo de oxígeno en varios pasos diferentes del ETS. Por lo tanto, este protocolo podría ayudar a responder preguntas clave sobre los mecanismos fundamentales que controlan el metabolismo en el contexto de muchas condiciones ambientales o patofisiológicos aprovechando el modelo de Drosophila.
Para medir el consumo de oxígeno en varios pasos diferentes del ETS y evaluar diferentes sustratos contribuyen a la respiración, diferentes sustratos (figura 1), uncoupler, y los inhibidores son usados30 después de permeabilización de las tejido. En concreto, se realizan adiciones secuenciales de diferentes sustratos para estimular la entrada de electrones a través de diversos complejos de la ETS. Cianuro de carbonilo de un uncoupler, 4-(de trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), luego se agrega en la concentración óptima para medir la respiración no juntada, es decir, estimula la respiración sin fosforilar al consumo máximo de oxígeno. Inhibiciones secuenciales de los complejos que i, II y III estamos entonces realizado para monitorear el consumo de oxígeno residual que se debe a reacciones de oxidación no-ETS. Por último, capacidad de respiración máxima de complejo IV puede ser evaluado por la inyección de N, N, N’, N, – tetrametil – p-Fenilendiamina (debe), un proveedor de electrones artificial y ascorbato. Es importante tener en cuenta que los experimentos se llevan a cabo a 24 °C ya que es la temperatura a la que se crían las moscas.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, se describe un método para la preparación de la muestra antes de las mediciones de consumo de oxígeno mitocondrial en Drosophila. Este método fue desarrollado para superar diferentes problemas relacionados con los protocolos usando aislamientos mitocondriales, especialmente en cuanto a la duración y el número de personas requerido. En vez de trabajar con aislamientos mitocondriales generalmente que requieren gran cantidad de tejidos obtenidos de varios individuos, se realiza este experimento en per…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue financiado por becas del nacional Ciencias y Consejo de investigación Ingeniería (NSERC, discovery grant) y Université de Moncton a NP. LHB gustaría reconocer el apoyo financiero del Instituto canadiense de investigación de la salud (CIHR), la Fundación de innovación de Nuevo Brunswick (NBIF) y Université de Moncton. El trabajo de EHC es apoyado por la sociedad de Alzheimer de Canadá Canadá cerebro, NSERC, Canadian Breast Cancer Foundation, Fundación de la innovación de New Brunswick, Fundación de investigación de salud de New Brunswick y Université de Moncton.
Materials
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Fine-tipped antimagnetic forceps | VWR | 82027-400 | |
| Secura225D-1S-DQE | Sartorius AG, Goettingen, Germany | Semi-micro balance (distributed by several companies) |
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| Drosophila melanogaster wild-type w1118 | Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA | Storage Condition: 24 °C |
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| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA Storage Condition: RT |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | Storage Condition: RT |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Storage Condition: -20 °C |
| MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | Storage Condition: RT |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | Storage Condition: RT |
| Na2Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | Storage Condition: -20 °C |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | Storage Condition: RT |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Storage Condition: 2-8 °C |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | Storage Condition: RT |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S7900 | Saponin Storage Condition: RT Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily. |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | Storage Condition: RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | Storage Condition: RT |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Storage Condition: RT |
| BSA | Sigma-Aldrich | 05470 | Storage Condition: 2-8 °C |
| Na2S2O4 | Sigma-Aldrich | 157953 | Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Pyruvate Storage Condition: 2-8 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily. |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | Malate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 °C. |
| Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A5285 | ADP Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 °C. |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | Cytochrome c Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Proline Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | Succinate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 °C. |
| sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt | Sigma-Aldrich | G7886 | Glycerol-3-phosphate Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 °C. |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 °C. |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 °C. |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage. Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily. |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 °C. |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | T7394 | TMPD Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Ascorbate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
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