Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Permeabilized Fasern von Drosophila mit minimalen Mengen von Gewebe

Der Taufliege Drosophila Melanogaster, dient als Modellorganismus für genetische Forschung für über ein Jahrhundert¹. Die Studie dieses Organismus führte nicht nur zu erheblichen Grundlagenwissen über geschlechtsgebundene Vererbung², Mutation Satz³, die Entwicklung des Nervensystems und die Zelle Schicksal Bestimmung⁴, sondern hat auch vor kurzem entstanden, als ein wertvolles Instrument, um die Mechanismen, die verschiedene Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson^5,6zu studieren. Darüber hinaus ist es ein beliebtes Modell, den Alterungsprozess zu studieren, da sie in großer Zahl über einen kurzen Zeitraum hinweg angehoben werden können und eine kurze Lebensdauer haben. Sie besitzen auch homologe Strukturen menschlicher Organe, wie Herz, Oenocytes (Hepatozyten-ähnliche Zellen), Fett Körper (funktionieren ähnlich wie die Leber und weißen Fettgewebe), Insulin produzierenden Zellen (β-Pankreaszellen entspricht), sowie die Hämolymphe Transport von Metaboliten (analog zu dem Blut der Wirbeltiere)⁷. Darüber hinaus sind die zentralen Bahnen des intermediären Stoffwechsels (einschließlich Insulin/Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-ähnliche Signalweg und Target of Rapamycin-TOR Wege) auch hoch konservierte⁷. Aus diesen Gründen Drosophila haben vor kurzem wurde ausgenutzt, um die grundlegenden Mechanismen zu beschreiben, die Stoffwechsel, vor allem in pathologischen Zuständen inhärenten menschlichen Stoffwechselerkrankungen wie Diabetes⁸steuern. Ein wichtiger Bestandteil des Stoffwechsels ist das Mitochondrium, das mehrere Wege integriert und führt eine der wichtigsten biologischen Lebensfunktionen, ATP-Produktion über die Oxidative Phosphorylierung-Verfahren (OXPHOS). Angesichts ihrer zentralen Rolle im Stoffwechsel des Organismus ist es nicht verwunderlich, dass die mitochondriale Funktionsstörungen bei vielen Erkrankungen wie Parkinson⁹ und Alzheimer Erkrankungen¹⁰sowie Amyotrophe Lateralsklerose beteiligt sind ^{11 , 12}. sie sind auch wesentliche Determinanten des Alterungsprozesses. In der Tat sind die Hauptproduzenten von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Zelle, die auf die Zelle in hoher Konzentration durch oxidativen Schäden¹¹nachteilig sein kann. Alterung wurde auch die Anhäufung von beschädigten oder mutierte mitochondriale DNA-¹³, Mitophagy Dysfunktionen^14,15 , sowie Beeinträchtigung der mitochondrialen Biogenese¹⁶gebracht. Mitochondrien sind ebenfalls wichtige Determinanten der Homöostase der Zelle, wie sie verschiedene Substrate anpassen verschiedene Zellfunktionen entsprechend der Fülle oder Mangel an Makronährstoffen^17,18nutzen können.

In der Tat sind die verschiedenen Nährstoffe in der Nahrung (Kohlenhydrate, Lipide und Proteine) verdaut, absorbiert und in die Zellen transportiert. Sie werden dann umgewandelt in das Zytosol, und die abgeleitete Substrate werden in der mitochondrialen Matrix, wo sie reduzierende Mittel, wie NADH und FADH₂^{19 produzieren,}transportiert. Diese Verringerung äquivalente werden dann von verschiedenen enzymatischen komplexen Elektronentransport-System (ETS) oxidiert. Diese komplexe sind eingebettet in die mitochondriale innere Membran, wie Komplex I und Komplex II. Darüber hinaus vertreten anderen enzymatischen komplexe wie die mitochondriale Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase und Prolin Dehydrogenase alternative Routen für die Eingabe von Elektronen in die ETS-^20,–²¹. Diese “alternative” komplexe sind besonders wichtig bei Insekten, können als je nach Tierart, sie aktiv um die Atmung^20,22,23,21zu erhöhen. Elektronen aus diesen ETS Zuführsysteme werden das Ubiquinon und anschließend zum Komplex III und dann Komplex IV, bis die endgültigen Akzeptor, molekularen Sauerstoff übertragen. Diese Elektronentransfer erzeugt eine Kraft, Proton-Motiv auf der inneren mitochondrialen Membran fahren die Phosphorylierung von ADP zu ATP bei komplexen V (Abbildung 1). Unter Berücksichtigung der zentralen Rolle der Mitochondrien in der Zelle Homöostase, mitochondrialen Stoffwechsel mit der relevanten Modell D. Melanogaster stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, die zugrunde liegenden Mechanismen der verschiedenen abzugrenzen pathophysiologischen Bedingungen oder unter Mobilfunk und Umwelt betont. Überraschend jedoch nur eine Handvoll Studien gemessen tatsächlich mitochondriale Atmung in Drosophila^24,25,26. Tatsächlich erfordern Experimente mit dem Ziel, mitochondriale Sauerstoffverbrauch bewerten die Isolation von Mitochondrien. Obwohl für die Messung der verschiedenen mitochondriale Funktionen (z. B. ROS-Produktion oder P/O Verhältnis als Marker der mitochondrialen Effizienz^27,28) vorteilhaft, erfordern diese Isolationen in der Regel ziemlich große Mengen Gewebe aus mehreren Individuen^24,29. Diese Anforderung für hohe Mengen von Gewebe und Einzelpersonen ist ein wichtiger begrenzende Faktor, besonders wenn man bedenkt, dass alle Personen, die im gleichen Alter sein sollte und vorzugsweise des gleichen Geschlechts für die Experimente machen das Maß der Atmung zu anderen Zeitpunkt am besten verweist mühsam. Darüber hinaus während mitochondriale Isolationen bedeutenden Einblick in die grundlegenden Mechanismen mitochondrialen Stoffwechsel zur Verfügung stellen können, haben die Methoden verwendet, um die Mitochondrien isolieren einige Nachteile wie die Schwierigkeit, reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen , Störungen der mitochondrialen Netz- und Veränderung der mitochondrialen Struktur und Funktion^29,30,31.

Das Ziel dieser Studie ist es, ein robustes Protokoll zur Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Drosophila mit nur eine minimale Menge an Gewebe aus sehr wenige Individuen zu präsentieren. Dieses Protokoll besteht aus mitochondriale Sauerstoff Verbrauch Messen in Situ mit permeabilized Muskelfasern²⁹ von Drosophila Thoraxes in Kombination mit hochauflösender respirometrie^{32,33, 34 , 35}. diese Methode hat auch weitere Vorteile im Vergleich zu den klassischen mitochondriale Isolationsmethode da die Interaktionen mit den anderen Komponenten der Zelle als auch mitochondrialen Struktur und Funktion in mehr konserviert werden permeabilized Fasern^29,31,36, wodurch dieser Ansatz mehr physiologisch relevanten. Mit diesem Protokoll können mitochondriale Funktionen genau mit hochauflösender respirometrie in nur drei Thoraxes von Drosophila, mit Substraten ermöglicht die Bestimmung der Sauerstoffverbrauch bei mehreren verschiedenen Schritten des ETS ausgewertet werden. Dieses Protokoll könnte daher wichtige Fragen über die grundlegenden Mechanismen helfen, die Stoffwechsel im Zusammenhang mit vielen Umwelt- oder pathophysiologischen Bedingungen zu steuern, unter Ausnutzung des Drosophila-Modells.

Den Sauerstoffverbrauch bei mehreren verschiedenen Schritten des ETS Messen und auswerten wie verschiedene Substrate tragen zur Atmung, verschiedene Substrate (Abbildung 1), Entkuppler und Inhibitoren sind gebrauchte³⁰ nach Permeabilisierung der der Gewebe. Insbesondere werden fortlaufende Ergänzungen von verschiedenen Substraten durchgeführt, um Regen die Einreise von Elektronen durch verschiedene komplexe des ETS. Ein Entkuppler Carbonyl Zyanid-4-(Trifluoromethoxy) Phenylhydrazone (FCCP), wird dann hinzugefügt, bei optimaler Konzentration, die Atmung nicht gekoppelt zu messen, d.h., die Atmung nicht Phosphorylierung stimuliert, um maximale Sauerstoff-Verbrauch. Sequentielle Hemmungen von komplexen I, II und III dann durchgeführt werden, um den Restsauerstoff-Verbrauch zu überwachen, der durch nicht-ETS-Oxidationsreaktionen ist. Zu guter Letzt Komplex IV maximal Atmung Kapazität ausgewertet werden kann, durch die Injektion von N, N, N’, N, – Tetramethyl – p-Phenylendiamin (TMPD), eine künstliche Elektron Anbieter und Ascorbat. Es ist wichtig zu beachten, dass die Experimente bei 24 °C durchgeführt werden, da es die Temperatur an der die fliegen ausgelöst werden.