Meting van mitochondriale zuurstofverbruik in permeabel vezels van Drosophila met minimale hoeveelheden weefsel

De fruitvlieg, Drosophila melanogaster, is gebruikt als een modelorganisme voor genetisch onderzoek voor meer dan een eeuw¹. De studie van dit organisme heeft niet alleen geleid tot belangrijke fundamentele kennis over geslachtsgebonden overerving², mutatie tarief³, de ontwikkeling van neurale systeem en de cel lot bepaling⁴, maar ook onlangs heeft ontpopt als een waardevol instrument te bestuderen van de mechanismen die inherent zijn aan verschillende ziekten zoals Alzheimer en Parkinson^5,6. Bovendien is het een populair model te bestuderen van het verouderingsproces, zoals ze in groot aantal over een korte periode van tijd kunnen worden verhoogd en een korte levensduur hebben. Zij bezitten ook homologe structuren aan menselijke organen, zoals een hart oenocytes (hepatocyte-achtige cellen), fat organen (functioneren op dezelfde manier als de lever en wit vetweefsel), de insuline producerende cellen (equivalent aan β-pancreatic cellen), evenals de Hemolymfe transport van metabolieten (analoog aan het bloed van gewervelde dieren)⁷. Bovendien is de centrale trajecten van intermediaire metabolisme (met inbegrip van de insuline/insuline-achtige groeifactor-achtige signalering traject en doel van Rapamycin-TOR trajecten) zijn ook zeer geconserveerde⁷. Om deze redenen hebben onlangs Drosophila benut om te beschrijven de fundamentele mechanismen waarmee metabolisme, vooral in pathologische omstandigheden die inherent zijn aan menselijke metabole ziekten zoals diabetes,⁸. Een belangrijk onderdeel van het metabolisme is het mitochondrion die integreert meerdere trajecten en voert een van life’s meest belangrijke biologische functies, productie van ATP, via de oxidatieve fosforylatie proces (OXPHOS). Gezien hun centrale rol in het metabolisme van het organisme is het niet verwonderlijk dat mitochondriale stoornissen zijn betrokken in vele ziekten zoals Parkinson,⁹ en¹⁰ziekten van Alzheimer, evenals in Amyotrofische laterale sclerose ^{11 , 12}. ze zijn ook fundamentele determinanten van het verouderingsproces. Inderdaad, ze zijn de belangrijkste producenten van reactieve zuurstof soorten (ROS) in de cel, die schadelijk voor de cel in hoge concentraties t/m¹¹van de oxidatieve schade zijn kan. Veroudering is ook gekoppeld aan de accumulatie van beschadigde of gemuteerde mitochondriaal DNA-¹³, mitophagy disfuncties^14,15 , alsmede bijzondere waardevermindering van mitochondriale biogenese¹⁶geweest. Mitochondriën zijn ook belangrijke determinanten van de cel van de homeostase als ze kunnen gebruik maken van verschillende substraten om aan te passen van de verschillende cellulaire functies aanroept volgens de overvloed of schaarste van macronutriënten^17,18.

Inderdaad, de verschillende voedingsstoffen in de voeding (koolhydraten, lipiden en eiwitten) zijn verteerd, geabsorbeerd en vervoerd in de cellen. Ze worden vervolgens getransformeerd in het cytosol en de afgeleide substraten worden getransporteerd naar de mitochondriale matrix waar ze verminderen equivalenten, zoals NADH en FADH₂–^{19 produceren}. Deze vermindering equivalenten zijn vervolgens geoxideerd door verschillende enzymatische complexen van het elektronentransport systeem (ETS). Deze complexen zijn ingebed in de mitochondriale binnenste membraan, zoals Complex I en complexe II. Bovendien vertegenwoordigen andere enzymatische complexen zoals de mitochondriale glycerol-3-fosfaat dehydrogenase en de proline dehydrogenase alternatieve routes voor de toetreding van de elektronen in de ETS^20,21. Deze ‘alternatieve’ complexen zijn met name belangrijk bij insecten, als gelang van de diersoort, zij kunnen actief deelnemen te verhogen van de ademhaling^20,22,23,21. Elektronen uit deze ETS Voersystemen worden overgebracht naar de ubiquinone en vervolgens complexe III, en vervolgens naar complexe IV, tot de definitieve acceptor, moleculaire zuurstof. Deze elektronen overdracht genereert een proton-stuwende kracht over de innerlijke mitochondriale membraan de fosforylatie van ADP rijden naar ATP bij complexe V (Figuur 1). Gezien de centrale rol van mitochondria in cel homeostase, bestuderen van mitochondriale metabolisme met behulp van het relevante model D. melanogaster vertegenwoordigt een krachtig hulpmiddel om af te bakenen de onderliggende mechanismen van diverse pathofysiologische voorwaarden of onder cellulaire en milieu benadrukt. Verrassend echter slechts een handvol studies gemeten eigenlijk mitochondriale ademhaling in Drosophila^24,25,26. Inderdaad, moeten experimenten gericht op het beoordelen van de mitochondriale zuurstofverbruik het isolement van de mitochondriën. Hoewel voordelig voor het meten van verschillende mitochondriale functies (zoals ROS productie of P/O verhouding als markering van mitochondriale efficiëntie^27,28), vereisen deze isolatie in het algemeen liever grote hoeveelheden van weefsel van verschillende individuen^24,29. Deze eis voor grote hoeveelheden weefsel en individuen is een belangrijke beperkende factor, vooral gezien het feit dat alle individuen dezelfde leeftijd moeten worden en bij voorkeur van hetzelfde geslacht voor de experimenten, waardoor de maatregel van de ademhaling op verschillende tijden moeizame wijst op zijn best. Bovendien, terwijl mitochondriale isolatie significante inzicht in de fundamentele mechanismen bestuur mitochondriale metabolisme bieden kunnen, de gebruikte methoden voor het isoleren van de mitochondriën hebben enkele nadelen zoals de moeilijkheid om repliceerbaar resultaten te verkrijgen , verstoring van de mitochondriale netwerk, en wijziging van mitochondriale structuur en functie^29,30,31.

Het doel van deze studie is te presenteren van een robuust protocol voor het meten van mitochondriale zuurstofverbruik in Drosophila met behulp van slechts een minimale hoeveelheid weefsel van zeer weinig individuen. Dit protocol bestaat uit het meten van mitochondriale zuurstof verbruik in situ spiervezels permeabel²⁹ van Drosophila thoraxes gebruiken in combinatie met hoge resolutie respirometrie^{32,33, 34 , 35}. deze methode heeft ook extra voordelen in vergelijking met de klassieke mitochondriale isolatie-methode omdat de interacties met de andere componenten van de cel als goed als mitochondriale structuur en functie worden meer bewaard in permeabel vezels^29,31,36, waardoor deze aanpak meer fysiologisch relevante. Met dit protocol, kunnen mitochondriale functies nauwkeurig getoetst met behulp van hoge-resolutie respirometrie in slechts drie thoraxes van Drosophila, met substraten toestaan van de bepaling van zuurstofverbruik in verschillende stappen van de ETS. Daarom kon dit protocol helpen beantwoorden van belangrijke vragen over de fundamentele mechanismen waarmee de stofwisseling in het kader van vele milieu- of pathofysiologische omstandigheden door te profiteren van de Drosophila model.

Meten van het zuurstofverbruik in verscheidene verschillende stappen van de ETS en evalueren van hoe verschillende substraten bijdragen aan de ademhaling, de verschillende substraten (Figuur 1), de uncoupler, en remmers zijn gebruikte³⁰ na permeabilization van de weefsel. Specifiek, worden opeenvolgende toevoegingen van verschillende substraten uitgevoerd om het stimuleren van de toetreding van elektronen door verschillende complexen van de ETS. Een uncoupler, carbonyl cyanide 4-(trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP), wordt vervolgens toegevoegd aan de optimale concentratie voor het meten van de ademhaling niet-gekoppeld, dat wil zeggen, de niet-phosphorylating ademhaling gestimuleerd om maximaal zuurstofverbruik. Opeenvolgende remmingen van complexen die i, II en III worden vervolgens uitgevoerd om te controleren de residuele zuurstofverbruik thats als gevolg van de niet-ETS oxidatiereacties. Ten slotte, complexe IV maximale ademhaling capaciteit kan worden geëvalueerd door de injectie van N, N, N’, N, – Tetramethyl – p-fenyleendiamine (TMPD), een kunstmatige elektron provider, en ascorbaat. Het is belangrijk op te merken dat de experimenten zijn uitgevoerd op 24 °C omdat het de temperatuur waarop de vliegen zijn gerezen.