Измерение потребления кислорода митохондрий в Permeabilized волокнах дрозофилы, используя минимальное количество ткани

Плодовой мушки Drosophila melanogaster, был использован как модельный организм для генетических исследований для более чем столетие¹. Исследование этого организма не только привела к значительным фундаментальных знаний о сцепленный с полом наследования², мутация ставка³, развитие нервной системы и определение судьбы клетки⁴, но также недавно стала ценный инструмент для изучения механизмов, присущих несколько таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера и Паркинсона^5,6. Кроме того это популярная модель для изучения процесса старения, как они могут быть подняты в большом количестве за короткий период времени и имеют короткий срок. Они также обладают гомологичных структур для человеческих органов, как сердце, oenocytes (гепатоцито подобных клеток), жир тела (аналогично функции печени и белой жировой ткани), инсулин производящ клетки (эквивалент клеток поджелудочной железы β), а также Гемолимфа транспортировки метаболитов (аналогично крови позвоночных)⁷. Кроме того Центральный путей промежуточного метаболизма (включая инсулин/инсулин подобный фактор роста как сигнальный путь и цель Rapamycin-Тор пути), также являются весьма сохраняется⁷. По этим причинам дрозофила недавно использовались для описания основных механизмов, которые контролируют метаболизм, особенно в патологических условиях присущие человеческой метаболических заболеваний, таких как диабет⁸. Одним из основных компонентов метаболизма является митохондрий, которая интегрирует множество путей и выполняет один из наиболее важных биологических функций жизни, производства АТФ, через процесс окислительного фосфорилирования (OXPHOS). Учитывая их центральную роль в метаболизме организма это не удивительно, что митохондриальной дисфункции участвуют во многих заболеваний как⁹ Паркинсона и Альцгеймера заболевания¹⁰, а также в боковой амиотрофический склероз ^{11 , 12}. они также являются фундаментальные детерминанты процесса старения. Действительно они являются основными производителями реактивнооксигенных видов (ров) в ячейке, которая может быть пагубным для ячейки при высокой концентрации через оксидативного повреждения¹¹. Старение также было связано к накоплению поврежденных или мутировавших митохондриальной ДНК¹³, mitophagy дисфункции^14,15 , а также ухудшение митохондриальной биогенеза¹⁶. Митохондрии являются также ключевыми факторами, определяющими гомеостаза клетки, как они могут использовать различные субстраты для настройки нескольких клеточных функций согласно изобилия или дефицит макроэлементов^17,18.

Действительно различные питательные вещества в рационе (углеводов, липидов и белков) переваривается, поглощаются и транспортируются в клетках. Затем они превращаются в цитозоле, и производные субстратов перевозятся в митохондриальной матрицу, где они производят сокращение эквиваленты, например NADH и ГВС₂¹⁹. Эти сокращения эквиваленты затем окисляется в различных ферментных комплексов транспортная система электронов (ETS). Эти комплексы, внедренные в митохондриальной внутренней мембраны, например комплекс I и II сложные. Кроме того другие ферментативные комплексы, такие как митохондриальных глицерин-3-фосфат-дегидрогеназы и пролина дегидрогеназа представляют собой альтернативные маршруты для вступления электронов в ETS^20,21. Эти «альтернативные» комплексы особенно важны в насекомых, как по видам, они могут активно участвовать увеличить дыхание^20,,2223,21. Электроны от этих ETS, системы кормления передаются убихинон и впоследствии для сложных III и затем комплекс CIV, до окончательного акцептор, молекулярный кислород. Этот перенос электрона генерирует Протон движущей силой всей внутренней митохондриальной мембраны, вождение фосфорилированием АДФ СПС в комплекс V (рис. 1). Учитывая центральную роль митохондрий в ячейки гомеостаза, изучение митохондриального метаболизма, используя соответствующие модели D. melanogaster представляет мощный инструмент для разграничения основных механизмов различных патофизиологические условия или под сотовой и экологические стрессы. Удивительно однако, лишь небольшое число исследований фактически измеряется митохондриальное дыхание в дрозофилы^24,25,26. Действительно эксперименты, стремясь оценить потребление кислорода митохондриальной требуют изоляции митохондрий. Хотя и выгодно для измерения различных митохондриальной функции (например, производство ROS или коэффициент P/O как маркер митохондриальной эффективности^27,28), эти изоляции, как правило, требуют довольно больших количествах Ткани из нескольких лиц^24,29. Это требование для высоких объемов ткани и лиц является важным сдерживающим фактором, особенно с учетом того, что все люди должны быть того же возраста и желательно того же пола для экспериментов, делая измерения дыхания в разное время Указывает трудоемкий в лучшем случае. Кроме того хотя митохондриальной изоляции может обеспечить значительно углубить понимание основных механизмов, регулирующих митохондриальной метаболизма, методы, используемые для изоляции митохондрии имеют ряд недостатков, таких, как трудности, чтобы получить воспроизводимые результаты , нарушение митохондриальной сети и изменения митохондриального структуры и функции^29,30,31.

Цель этого исследования заключается в представлении надежный протокол для измерения потребления митохондриальной кислорода у дрозофилы, используя только минимальное количество ткани от очень мало людей. Этот протокол состоит из измерения митохондрий кислородом потребления на месте с помощью²⁹ permeabilized мышечных волокон от дрозофилы thoraxes в сочетании с высоким разрешением respirometry^{32,33, 34 , 35}. Этот метод также имеет дополнительные преимущества по сравнению с методом классической митохондриальной изоляции, поскольку взаимодействия с другими компонентами клетки как хорошо как митохондриальных структуры и функции более сохранились в permeabilized волокна^29,,3136, что делает этот подход более физиологически соответствующих. Этот протокол митохондриальной функции можно точно оцениваться с использованием высокого разрешения respirometry в только три thoraxes дрозофилы, с субстратами, позволяя определение потребления кислорода на нескольких разных ступенях ETS. Таким образом этот протокол может помочь ответить на ключевые вопросы о основных механизмов, которые контролируют метаболизм в контексте многих условий окружающей среды или патофизиологические, воспользовавшись дрозофилы модели.

Измерение потребления кислорода в несколько различных этапов ETS и оценить как различные субстраты способствуют дыхания, разных субстратах (рис. 1), uncoupler, и ингибиторы используется³⁰ после permeabilization из ткани. В частности последовательного добавления различных субстратов выполняются для стимулирования вступления электронов через различные комплексы ETS. Uncoupler, карбонил цианид 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), затем добавляется в оптимальной концентрации для измерения-сочетании дыхания, т.е. -phosphorylating дыхание стимулировали потребление кислорода Максимальная. Последовательного ингибитирований комплексов, которые I, II и III затем выполняются для мониторинга потребления остаточного кислорода, что обусловлено реакции окисления-ETS. Наконец, комплекс IV максимальной дыхание потенциала может оцениваться путем инъекций N, N, N’, N, p – тетраметилсвинца–фенилендиамином (TMPD), поставщик искусственного электрона и аскорбата. Важно отметить, что эксперименты проводятся при 24 °C, так как это температура, при котором вызываются мух.