Misura del consumo di ossigeno mitocondriale nelle fibre Permeabilized di Drosophila utilizzando la minima quantità di tessuto

Moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è stato utilizzato come organismo modello per la ricerca genetica per sopra un secolo¹. Lo studio di questo organismo non ha solo portato a significative conoscenze fondamentali sull’ereditarietà legata al sesso², mutazione tasso³, lo sviluppo del sistema neurale e la determinazione di destino cella⁴, ma anche recentemente è emerso come un strumento prezioso per studiare i meccanismi inerenti alle diverse malattie come Alzheimer e Parkinson^5,6. Inoltre, è un modello popolare per studiare il processo di invecchiamento, in quanto può essere sollevate in gran numero per un breve periodo di tempo e hanno una durata breve. Inoltre possiedono strutture omologhe degli organi umani, come un cuore, corpi grassi (funziona allo stesso modo come il tessuto adiposo bianco e fegato), oenocytes (hepatocyte-come le cellule), insulina producendo le cellule (equivalente a cellule β-pancreatiche), nonché la emolinfa trasporta metaboliti (analogo al sangue dei vertebrati)⁷. Inoltre, le vie centrali del metabolismo intermedio (tra cui la via di segnalazione dell’insulina/insulina-come il fattore di crescita e i percorsi del bersaglio della rapamicina-TOR) sono altamente conservato⁷. Per questi motivi, Drosophila recentemente sono state sfruttate per descrivere i meccanismi fondamentali che controllano il metabolismo, soprattutto in condizioni patologiche inerenti umani malattie metaboliche come il diabete⁸. Una componente importante del metabolismo è il mitocondrio che integra le vie multiple ed esegue una delle più importanti funzioni biologiche della vita, produzione di ATP, tramite il processo di fosforilazione ossidativa (OXPHOS). Considerando il loro ruolo centrale nel metabolismo dell’organismo, non è sorprendente che le disfunzioni mitocondriali sono coinvolti in molte malattie come il morbo di Parkinson⁹ e morbo di Alzheimer malattie¹⁰, così come nella sclerosi laterale amiotrofica ^{11 , 12}. sono anche determinanti fondamentali del processo di invecchiamento. Infatti, sono i principali produttori di specie reattive dell’ossigeno (ROS) nella cellula, che può essere dannosa per la cella ad alta concentrazione a danni ossidativi¹¹. Invecchiamento inoltre è stata associata all’accumulo di DNA danneggiato o mutato mitocondriale¹³, mitophagy disfunzioni^14,15 , così come danno della biogenesi mitocondriale¹⁶. I mitocondri sono anche determinanti dell’omeostasi della cella come possono utilizzare diversi substrati per regolare diverse funzioni cellulari secondo l’abbondanza o la scarsità di macronutrienti^17,18.

Infatti, le diverse sostanze nutritive nella dieta (carboidrati, lipidi e proteine) sono digerite, assorbite e trasportate nelle cellule. Vengono poi trasformati nel citosol, e i substrati derivati vengono trasportati nella matrice mitocondriale dove si producono equivalenti riducenti, quali NADH e FADH₂¹⁹. Questi equivalenti riducenti sono quindi ossidati dai diversi complessi enzimatici del sistema di trasporto dell’elettrone (ETS). Questi complessi vengono incorporati nella membrana mitocondriale interna, come complesso I e II complesso. Inoltre, altri complessi enzimatici come il glicerolo-3-fosfato deidrogenasi mitocondriale e la deidrogenasi di prolina rappresentano percorsi alternativi per la voce di elettroni in ETS^20,21. Questi complessi ‘alternativi’ sono particolarmente importanti in insetti, come secondo le specie, possono partecipare attivamente per aumentare la respirazione^20,22,23,21. Elettroni da questi sistemi di alimentazione di ETS sono trasferiti ad l’ubiquinone e successivamente al complesso III e quindi al complesso IV, fino al ricettore finale, ossigeno molecolare. Questo trasferimento di elettroni genera una Forza Protonomotrice attraverso la membrana mitocondriale interna guida la fosforilazione di ADP in ATP al complesso V (Figura 1). Considerando il ruolo centrale dei mitocondri nell’omeostasi della cella, studiando il metabolismo mitocondriale utilizzando il relativo modello d. melanogaster rappresenta un potente strumento per delineare i meccanismi di fondo di varie fisiopatologico condizioni o sotto stress cellulare e ambientale. Sorprendentemente però, solo una manciata di studi effettivamente misurati la respirazione mitocondriale in Drosophila^24,25,26. Infatti, gli esperimenti con l’obiettivo di valutare il consumo di ossigeno mitocondriale richiedono l’isolamento dei mitocondri. Anche se vantaggioso per la misurazione delle diverse funzioni mitocondriali (ad esempio produzione di ROS o rapporto di P/O come indicatore di efficienza mitocondriale^27,28), questi isolamenti richiedono generalmente piuttosto grandi quantità del tessuto da diversi individui^24,29. Questo requisito per elevate quantità di tessuto e di individui è un importante fattore limitante, soprattutto se si considera che tutti gli individui dovrebbero essere della stessa età e preferibilmente dello stesso sesso per gli esperimenti, rendendo la misura della respirazione in tempi diversi punti laborioso nella migliore delle ipotesi. Inoltre, mentre gli isolamenti mitocondriali possono fornire significativi comprensione dei meccanismi fondamentali che regolano il metabolismo mitocondriale, i metodi utilizzati per isolare i mitocondri hanno diversi inconvenienti come la difficoltà di ottenere risultati replicabili , la rottura della rete mitocondriale e alterazione di mitocondriale struttura e funzione^29,30,31.

Lo scopo di questo studio è di presentare un protocollo robusto per misurare il consumo di ossigeno mitocondriale in Drosophila usando solo una minima quantità di tessuto da pochissimi individui. Questo protocollo consiste nel misurare ossigeno mitocondriale consumo in situ utilizzando fibre muscolari permeabilized²⁹ da toraci di Drosophila in combinazione con alta risoluzione respirometry^{32,33, 34 , 35}. questo metodo ha anche altri vantaggi rispetto al metodo classico isolamento mitocondriale poiché le interazioni con gli altri componenti della cellula come bene come mitocondriale struttura e funzione sono più conservati in permeabilizzate fibre^29,31,36, che rende questo approccio più fisiologicamente rilevanti. Con questo protocollo, funzioni mitocondriali possono essere accuratamente valutate utilizzando manometrica ad alta risoluzione in solo tre toraci di Drosophila, con substrati permettendo la determinazione del consumo di ossigeno alle diverse fasi dell’ETS. Di conseguenza, questo protocollo potrebbe aiutare rispondere alle domande fondamentali circa i meccanismi fondamentali che controllano il metabolismo nel contesto delle diverse condizioni ambientali o patofisiologiche sfruttando il modello di Drosophila.

Per misurare il consumo di ossigeno alle diverse fasi dell’ETS e valutare come i diversi substrati contribuiscono alla respirazione, diversi substrati (Figura 1), disaccoppiatore, e inibitori sono usati³⁰ dopo permeabilizzazione della tessuto. In particolare, aggiunte sequenziale di diversi substrati vengono eseguite per stimolare l’entrata di elettroni attraverso diversi complessi dell’ETS. Un disaccoppiatore, Carbonil cianuro 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), viene quindi aggiunto a concentrazione ottimale per misurare la respirazione non accoppiati, cioè, la respirazione non fosforilante stimolata al massimo consumo di ossigeno. Inibizioni sequenziale dei complessi che i, II e III stiamo quindi eseguita per monitorare il consumo di ossigeno residuo che è a causa di reazioni di ossidazione del non-ETS. Infine, capacità di respirazione massima complesso IV può essere valutata tramite l’iniezione di N, N, N’, N, – tetrametil – p-fenilendiammina (TMPD), un elettrone artificiale provider e ascorbato. È importante notare che gli esperimenti sono condotti a 24 °C, dal momento che è la temperatura alla quale vengono generati i mosche.