ショウジョウバエのティッシュの最小限の量を使用してのグリセリンの繊維でミトコンドリアの酸素消費量の測定

ミバエショウジョウバエは、¹世紀以上の遺伝子研究のモデル生物として使用されています。この生物の研究伴性継承²、突然変異率³、ニューラル システムの開発と細胞運命決定の⁴の重要な基礎知識にしかつながっていないが、また最近として浮上している、アルツハイマー病やパーキンソン病の^5,6などいくつかの疾患に固有のメカニズムを研究する貴重なツールです。さらに、彼らは時間の短い期間で大量に発生する可能性が、寿命が短いと老化のプロセスを勉強する人気のあるモデルです。彼らはまた、インスリン産生細胞 (β 膵細胞に相当)、脂肪体 (同様には肝と白脂肪組織として機能している)、oenocytes (肝細胞様細胞)、心臓などの臓器に相同構造を所有しているだけでなく、体液代謝産物 (脊椎動物の血に似ています)⁷を輸送します。また、中間代謝 (インスリン/インスリン様成長因子のようなシグナル伝達経路およびラパマイシン ターゲット TOR 経路含む) の中央の道は、また非常に節約された⁷です。これらの理由から、ショウジョウバエは最近⁸糖尿病など代謝疾患固有の病態を中心に、代謝を制御する基本的なメカニズムを記述するため悪用されています。代謝の主要なコンポーネントは酸化的リン酸化プロセス (OXPHOS) を通じて ATP 生産、ミトコンドリア複数の経路を統合し、生命の最も重要な生物学的機能のいずれかを実行します。生物の代謝の中心的な役割を考慮したそれは、ミトコンドリアの機能障害がパーキンソン病⁹とアルツハイマー病¹⁰のような多くの病気だけでなく、筋萎縮性側索硬化症に関与していること意外ではないです。^11,12. 老化プロセスの基本的な決定要因があります。確かに、酸化損傷¹¹を通じて高濃度の細胞に有害なことができる細胞活性酸素種 (ROS) の主要な生産者しています。高齢化はまた破損または変異ミトコンドリア DNA¹³mitophagy 機能障害^14,15ミトコンドリア生合成¹⁶障害の蓄積に関連付けられています。ミトコンドリアは細胞の恒常性の重要要因ではまた豊富や栄養素^17,18の希少性によるといくつかの細胞機能を調節する別の基板を利用することができます。

確かに、ダイエット (炭水化物、脂質および蛋白質) のさまざまな栄養素に消化され、吸収され、細胞に運ばれます。細胞質に転化し、派生の基板は NADH や FADH₂¹⁹などの削減の同等物を製造しているミトコンドリアのマトリックスに運ばれます。これらの削減の同等は、電子輸送システム (ETS) の異なる酵素の複合体によって酸化されてし。これらの複合体は複合体など、ミトコンドリア内膜に埋め込まれている私と複合体 II。さらに、ミトコンドリアのグリセロール-3-リン酸脱水素酵素およびプロリン脱水素酵素など他の酵素の複合体は、ETS^20,21に電子のエントリの代替ルートを表します。これらの ‘alternative’ 複合体は昆虫、特に重要として、種に応じて彼ら積極的に参加できる呼吸^20,22,23,21を増加します。これらの ETS の供給システムからの電子は、最終的なアクセプター分子酸素まで、ユビキノン、その後複合体 III にし複雑な IV が転送されます。この電子の移動は、複雑な V (図 1) で ATP を ADP のリン酸化を運転内部のミトコンドリア膜プロトン動機力を生成します。病態生理学的ミトコンドリア細胞の恒常性は、キイロショウジョウバエ関連するモデルを表しますを用いたミトコンドリア代謝の勉強の中心的な役割の様々 なメカニズムを記述する強力なツールを検討条件または細胞と環境ストレスの下で。驚くほどしかし、研究の一握りだけは実際にショウジョウバエ^24,25,26のミトコンドリアの呼吸を測定しました。確かに、ミトコンドリアの酸素消費量を評価することを目指して実験はミトコンドリアの分離を必要とします。分離が一般的にむしろ大量を必要とする (活性酸素産生やミトコンドリア効率^27,28のマーカーとしての P/O 率) などさまざまなミトコンドリア機能の測定のために有利、いくつか個人^24,29からのティッシュ。組織や個人の多量のためのこの要件は、重要な制限要因、特にすべての個人が同じ年齢であることを考えるとできれば実験のための同性の異なる時間に呼吸のメジャーを作る最高の状態で骨の折れるポイントします。さらに、ミトコンドリアの分離は、ミトコンドリア代謝を支配する根本的なメカニズムに重要な洞察力を提供できますが、ミトコンドリアの分離に使用するメソッドはレプリケート可能な結果を得ることの難しさなどいくつか欠点を持ってください。、ミトコンドリアのネットワークおよびミトコンドリアの構造と機能^29,30,31の変質の中断。

本研究の目的は、非常に少数の個人から組織の最小限の量だけを用いたショウジョウバエのミトコンドリアの酸素消費量を測定するための堅牢なプロトコルを提示することです。このプロトコルでミトコンドリアの酸素消費量測定の in situショウジョウバエ thoraxes からグリセリン筋線維²⁹を使用して高解像度呼吸^32,33,との組み合わせで構成されています^34,35ですこのメソッドも古典的なミトコンドリアの分離メソッドからセルの他のコンポーネントとの相互作用としても、ミトコンドリアの構造と機能はの保存よりグリセリンに比べて利点があります。繊維^29,31,36, もっと生理学的に関連するこのアプローチになります。このプロトコルで、基板 ETS のいくつかの異なる段階で酸素消費量の決定をすること、ショウジョウバエの唯一の 3 つの thoraxes で使用する高解像度の呼吸ミトコンドリア機能することができます正確に評価されます。したがって、このプロトコルはショウジョウバエ モデルの利点を生かして多くの環境または病態生理学的条件のコンテキストで代謝を制御する基本的なメカニズムに関する質問に回答キーを助けることができます。

ETS のいくつかの異なる手順で酸素消費量を測定し、どのように異なる基板を評価する呼吸、別基板 (図 1)、ランプに貢献し、阻害剤が使用される³⁰の透過後、組織。具体的には、異なる基板上の順次追加、ETS の異なる複合体を介して電子のエントリを刺激するために実行されます。シアン化物のカルボニル、ランプ 4-(フッ素系低分子) phenylhydrazone (FCCP) は非結合呼吸を測定するための最適な濃度で追加した、すなわち、非リン酸化呼吸筋酸素消費量刺激されます。複合体 I、II、および III は ETS 非酸化反応により、残留酸素の消費量を監視する実行し、順次抑制。N, N, N の注入による複雑な IV 最大呼吸能力を評価できる最後に、’、N – テトラメチル – p-フェニレンジアミン (受けた東京都警視庁)、人工電子プロバイダーとアスコルビン酸。それはハエの発生する温度なので、24 °C で実験が行われているに注意してくださいすることが重要です。