Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad
Summary
Se presenta un protocolo para el aislamiento de primaria microglia del cerebro murino. Esta técnica ayuda a promover la comprensión actual de condiciones neurológicas. Centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética se combinan para producir suficiente rendimiento de una muestra muy pura. Además, describiremos los pasos para la caracterización de la microglia.
Abstract
Microglia, las células inmunes residentes en el cerebro, son los primeros respondientes a los inflamación o lesiones en el sistema nervioso central. La investigación reciente ha revelado microglia a ser dinámico, capaz de asumir fenotipos pro inflamatorias y antiinflamatorios. Tanto M1 (pro inflamatorio) y M2 fenotipos (pro-reparadora) juego un papel importante en capensis condiciones tales como lesión cerebral perinatal y exposición de diferentes funciones en respuesta a ciertos estímulos ambientales. La modulación de la activación microglial se ha observado para conferir neuroprotección así sugiriendo la microglía puede tener potencial terapéutico en el daño cerebral. Sin embargo, se requiere más investigación para comprender mejor el papel de la microglia en la enfermedad, y este protocolo facilita. El protocolo describe a continuación combina un proceso de centrifugación del gradiente de densidad para reducir desechos celulares, con separación magnética, produciendo una muestra muy pura de las células microgliales primaria que pueden utilizarse para la experimentación in vitro , sin la necesidad de 2 a 3 semanas de cultivo. Además, los pasos de caracterización rendimiento robustos datos funcionales sobre la microglia, ayudando a los estudios para mejorar nuestra comprensión de la polarización y cebado de estas células, que tiene fuertes implicaciones en el campo de la medicina regenerativa.
Introduction
Daño adquirido durante el período de inflamación, hipoxia isquemia y hemorragia perinatal puede tener una serie de secuelas a largo plazo. La teoría de la compleja Fisiopatología de la lesión cerebral perinatal es involucrar a la inflamación y la isquemia con posterior muerte neuronal y axonal1. La respuesta inmunitaria innata desempeña un papel importante en la cascada de eventos que llevan a lesión2.
Microglia, las células inmunes residentes en sistema nervioso central (SNC), son los primeros respondientes a lesiones3. Microglia son tipos de células de plástico con capacidad de ser protector o tóxico, dependiente en el medio ambiente4. Están involucrados en la quimiotaxis, fagocitosis, presentación del antígeno y la producción de citocinas y especies de oxígeno reactivo4,5. Microglia senescente constantemente encuesta sobre el medio ambiente y se activan por la presencia de una sustancia perjudicial o extranjeros4. La activación conduce a una respuesta proinflamatoria, crítica en el CNS protección4. Estos M1 “inflamatorias” fenotipo microglia participan principalmente en la presentación del antígeno y la muerte de patógenos4. A pesar del papel crucial de la respuesta inflamatoria en la neuroprotección, inflamación incontrolada o prolongada puede ser perjudicial y conducir a daño neuronal4. Sin embargo, cuando se expone a ciertos estímulos ambientales, microglia puede exhibir un fenotipo antiinflamatorio. Estos pro-reparadora microglia M2 tienen un papel fundamental en la cicatrización de heridas y reparación6, lanzando una gama de citoquinas y otros mediadores solubles que regular a la baja la inflamación, aumentan la fagocitosis y promover la reparación de4, 7. los papeles de microglia son diversos e incluyen diferenciación de oligodendrocyte conducción durante re-mielinización8, protegiendo las neuronas durante la depleción de oxígeno y glucosa en tiempos modelos9 y promoción de la consecuencia del neurite en 10los modelos de lesión de la médula espinal.
El estudio de estas células gliales representa un aspecto importante en la comprensión y manipulación de la respuesta a la neuroinflamación. El protocolo descrito permite más investigación sobre el potencial terapéutico de la modulación de la microglia en afecciones capensis.
La modulación de la activación microglial hacia un papel neuroprotector se ha observado en una amplia gama de condiciones11,12,13. Por lo tanto, mejorar la comprensión actual y estudiar más la modulación de la activación microglial es crítica, que requieren el uso de varios modelos, incluyendo tanto in vitro como in vivo. In vitro los estudios representan una herramienta importante debido a su mayor eficiencia, menor costo y su capacidad para investigar una población aislada de la célula.
Hay una gama de protocolos descritos en la literatura para el aislamiento de la microglia del cerebro murino, el desafío de producir eficientemente una muestra de alto rendimiento con buena viabilidad y pureza elevada. Utilizado métodos de aislamiento de microglia primaria son por separación magnética y prolongado temblor de cultivos gliales mixtos. A través de la experiencia personal, se encontró que existía un alto grado de desechos celulares que obstruyó la columna magnética. Por lo tanto, se utilizó el siguiente protocolo, que incorpora un paso de centrifugación del gradiente de densidad inicial seguido por la separación magnética de CD11b. El protocolo que se describe a continuación ha sido optimizado para producir una muestra muy pura en cantidad suficiente. Es ventajoso debido a su alta pureza y el corto período de tiempo, uno puede realizar análisis dentro de 2 días sin tener a la cultura durante 2-3 semanas. Potencialmente se puede adaptar este protocolo para el aislamiento de astrocitos murinos primarios.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia tienen la capacidad de ser pro – y antiinflamatoria, alterada por los estímulos del medio ambiente. Estudios anteriores han demostrado que la modulación de la activación de la microglía puede conferir neuroprotección. Su capacidad para proporcionar protección a las neuronas y reparar lesiones requiere más investigación para la comprensión actual de estas células complejas. Así, aislamiento de alta pureza primaria microglia es una técnica importante y útil. Este es un método relativamente rápido p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
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