توصيف والعزلة للماوس Microglia الأولية بكثافة التدرج الطرد المركزي
Summary
ويرد بروتوكول لعزل microglia الأولية من العقول مورين. يساعد هذا الأسلوب في الفهم الحالي للظروف العصبية. يتم الجمع بين الكثافة المتدرجة الطرد المركزي والفصل المغناطيسي لإنتاج المحصول كافياً من عينة نقية جداً. وعلاوة على ذلك، فإننا مخطط الخطوات اللازمة لتوصيف microglia.
Abstract
Microglia، الخلايا المناعية المقيم في الدماغ، وهي أول المستجيبين لالتهاب أو إصابة في الجهاز العصبي المركزي. وقد كشفت الأبحاث الأخيرة ميكروجليا لتكون قادرة على تولي تعمل كل برو-التهابات والالتهابات، ودينامية. M1 (برو-التهابات) و M2 (برو الترميمي) تعمل تلعب دوراً مهما في الظروف نيوروينفلاماتوري مثل إصابة في الدماغ قبل الولادة، واختلاف معرض الوظائف استجابة لبعض المؤثرات البيئية. وقد لوحظ تحوير microglial التنشيط لإضفاء نيوروبروتيكتيون مما يوحي microglia قد الإمكانات العلاجية في إصابة في المخ. ومع ذلك، مطلوب إجراء مزيد من البحوث لتحسين فهم دور microglia في المرض، وهذا البروتوكول يسهل أن. البروتوكول هو موضح أدناه يجمع بين عملية الطرد المركزي تدرج كثافة الحد من الحطام الخلوية، مع فصل المغناطيسية، إنتاج عينة نقية جداً من خلايا microglial الأولية التي يمكن استخدامها لإجراء التجارب في المختبر ، دون الحاجة إلى 2-3 أسابيع استزراع. بالإضافة إلى ذلك، وصف الخطوات التي تسفر عن بيانات وظيفية قوية حول microglia، مساعدة دراسات لتحسين فهمنا للاستقطاب وفتيلة من هذه الخلايا، التي لها آثار قوية في مجال الطب التجديدي.
Introduction
الأضرار التي حصلت خلال فترة ما حول الولادة من الالتهاب، التاكسج احتباس الدم والنزيف يمكن أن يكون صفيف عقابيل على المدى الطويل. هي نظرية الفسيولوجيا المرضية المعقدة لإصابة في الدماغ قبل الولادة إلى إشراك التهاب والاسكيميه التي تلت موت الخلايا العصبية ومحواري1. الاستجابة المناعية الفطرية دوراً هاما في سلسلة الأحداث التي أدت إلى إصابة2.
Microglia، الخلايا المناعية المقيمين داخل الجهاز العصبي المركزي (CNS)، هي أول المستجيبين لإصابة3. ميكروجليا أنواع البلاستيك الخلية مع القدرة على أن تكون وقائية أو السامة، سواء التي تعتمد على البيئة4. أنهم متورطون في إنزيمية، البلعمه، مستضد العرض التقديمي وإنتاج السيتوكينات والأكسجين التفاعلية الأنواع4،5. ميكروجليا مسن باستمرار مسح البيئة ويتم تنشيطها بوجود مادة ضارة أو أجنبية4. ويؤدي التنشيط إلى استجابة برو تحريضية، أهمية حاسمة في حماية الجهاز العصبي المركزي4. هذه microglia النمط الظاهري “برو-التحريضية” M1 تشارك أساسا في مستضد العرض التقديمي والموت من مسببات الأمراض4. رغم الدور الحاسم للاستجابة الالتهابية في نيوروبروتيكشن، التهاب غير المنضبط أو لفترات طويلة يمكن أن تكون ضارة وتؤدي إلى تلف الخلايا العصبية4. ومع ذلك، عند التعرض لبعض المؤثرات البيئية، يمكن أن يحمل microglia النمط الظاهري للالتهابات. هذه microglia M2 برو الترميمي لها دور حاسم في التئام الجروح وإصلاح6، الإفراج عن مجموعة من السيتوكينات والوسطاء الآخرين للذوبان أن التهاب downregulate، زيادة البلعمه وتعزيز إصلاح4، 7-أدوار microglia متنوعة وتشمل التمايز oligodendrocyte القيادة أثناء إعادة-مييلينيشن8، حماية الخلايا العصبية من خلال استنزاف الأوكسجين والجلوكوز في السكتة الدماغية نماذج9 وتعزيز ثمرة نورت في إصابات النخاع الشوكي ونماذج10.
دراسة هذه الخلايا الدبقية يمثل جانبا مهما في فهم ومعالجة الرد على نيوروينفلاميشن. وصف بروتوكول يسمح للمزيد من التحقيق في القدرة العلاجية للتحوير microglia في اضطرابات نيوروينفلاماتوري.
وقد لوحظ تحوير التنشيط microglial نحو دور محصن في طائفة من الظروف11،،من1213. وبالتالي، تحسين الفهم الحالي ومواصلة دراسة تحوير microglial التنشيط الحرجة، التي تتطلب استخدام نماذج مختلفة بما في ذلك على حد سواء في المختبر و في فيفو. في المختبر الدراسات تمثل أداة هامة نظراً لزيادة كفاءتها وأقل تكلفة والقدرة على التحقيق في نسبة سكان خلية معزولة.
وهناك مجموعة من البروتوكولات المذكورة في الأدب لعزل ميكروجليا من العقول مورين، التحدي المتمثل في كفاءة إنتاج عالية غلة عينة مع بقاء جيدة ودرجة نقاء عالية. أساليب شائعة لعزل microglia الأولية بالفصل المغناطيسي وتهز المطول للثقافات الدبقية مختلطة. من خلال تجربة شخصية، ووجد أن هناك درجة عالية من الحطام الخلوية التي أعاقت العمود المغناطيسي. وبالتالي، استخدم البروتوكول التالي، الذي يتضمن خطوة الطرد المركزي تدرج كثافة أولية متبوعاً بالفصل المغناطيسي CD11b. وقد تم تحسين البروتوكول، المذكورة أدناه لإنتاج عينة نقية جداً بكميات كافية. فإنه من المفيد درجة نقاء عالية وفترة زمنية قصيرة بسبب — واحد يمكن إجراء فحوصات خلال يومين دون الحاجة إلى الثقافة لمدة 2-3 أسابيع. هذا البروتوكول يمكن تكييفها محتملة لعزل astrocytes موريني الأولية.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia لديها القدرة على أن برو والمضادة للالتهابات، غيرت من المحفزات البيئة. وقد أظهرت الدراسات السابقة يمكن أن يضفي تحوير microglia التنشيط نيوروبروتيكشن. قدرتها على توفير الحماية للخلايا العصبية وإصلاح الضرر يتطلب إجراء مزيد من البحوث مزيد من الفهم الحالي لهذه الخلايا معقدة. وهكذا، عزل microgli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
References
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).
- Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
- Uwe-Karsten, H., Helmut, K. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).
- Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O’Banion, M. K. Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed. Journal of neuroinflammation. 11, 98 (2014).
- Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).
- Guohua, W., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864 (2013).
- Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2009).
- Veronique, E. M., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nature Neuroscience. 16 (9), 1211 (2013).
- Hu, X., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia. Stroke. 43 (11), 3063 (2012).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).
- Suzuki, T. Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role. Journal of neuroscience research. 83, (2006).
- Bedi, S. S. Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury. Stem cells translational medicine. 2, (2013).
- Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection. Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System. PLOS ONE. 11 (2), e0150290 (2016).
- Leaw, B., et al. Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury. Stem cell research & therapy. 8 (1), 46 (2017).
- Moujalled, D., et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).
