Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu
Summary
Bir iletişim kuralı üzerinden fare beyni birincil microglia yalıtım için sunulmaktadır. Bu teknik nörolojik koşullar geçerli anlayışı sürdürmek yardımcı olur. Yoğunluk gradient Santrifüjü ve manyetik ayırma son derece saf bir örnek yeterli verim üretmek için birleştirilmiştir. Ayrıca, biz microglia karakterizasyonu için adımlar verilmiştir.
Abstract
Microglia, beyin, yerleşik bağışıklık hücreleri iltihap veya Merkezi sinir sistemine yaralanmaya ilk yardım ekipleri vardır. Son araştırma dinamik, pro-inflamatuar ve anti-inflamatuar fenotipleri varsayarak kabil olmak microglia ortaya koymuştur. Hem (pro-inflamatuar) M1 ve M2 (pro-onarıcı) fenotipleri oyun neuroinflammatory koşulları perinatal beyin hasarı ve sergi farklı gibi önemli bir rol belirli çevresel uyaranlara yanıt olarak işlev görür. Mikroglial harekete geçirmek modülasyon böylece microglia tedavi edici potansiyeli beyin hasarı olabilir düşündüren neuroprotection görüşmek için Not edildi. Ancak, daha fazla araştırma microglia hastalığında rolünün daha iyi anlamak için gereklidir ve bu iletişim kuralı bu kolaylaştırır. Protokol altında birleştiren son derece saf bir örnek içinde vitro deneyler için olmadan kullanılabilir birincil mikroglial hücre üreten manyetik ayırma ile hücresel enkaz azaltmak için bir yoğunluk degrade Santrifüjü işlemi açıklanmıştır. 2-3 hafta kültür gerek. Ayrıca, karakterizasyonu adımları rejeneratif tıp alanında güçlü etkileri vardır polarizasyon anlayışımızı geliştirmek için çalışmalar yardım ve bu hücrelerin priming microglia hakkında sağlam işlevsel veri verim.
Introduction
İnflamasyon, hipoksik iskemisi ve kanaması perinatal dönemde edinilen hasar uzun vadeli sekel bir dizi olabilir. Perinatal beyin hasarı karmaşık Patofizyoloji inflamasyon ve ardından gelen nöronal ve aksonal ölüm1iskemi dahil etmek teorisini. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı olaylar yaralanma2‘ ye çağlayan önemli bir rol oynar.
Microglia, merkezi sinir sistemi (MSS), içinde yerleşik bağışıklık hücreleri yaralanma3ilk yardım ekipleri vardır. Microglia plastik hücre türü kapasiteli çevre4koruyucu veya toksik, bağımlı olmak vardır. Onlar Kemotaksis, fagositoz, antijen sunumu ve üretim sitokinler ve Reaktif oksijen türleri4,5yer alırlar. Senescent microglia sürekli çevre anket ve bir yabancı veya zararlı madde4varlığı ile aktif hale gelir. Harekete geçirmek bir pro-inflamatuar yanıt, CNS koruma4‘ te kritik yol açar. Bu M1 “pro-inflamatuar” fenotip microglia öncelikle antijen sunumu ve patojenler4ölüm söz konusu. Neuroprotection inflamatuvar yanıtta önemli rol rağmen zararlı ve nöronal hasar4kurşun kontrolsüz veya uzun süreli iltihap olabilir. Ancak, bazı çevresel uyaranlara maruz kaldığında, microglia bir anti-inflamatuar fenotip sergi. Bu pro-onarıcı M2 microglia iyileşmesi ve sitokinler bir dizi bırakmadan6, onarım kritik bir rol var ve diğer çözünür arabulucu tümleyici inflamasyon, fagositoz artırmak ve teşvik4, tamir 7. microglia roller çeşitlidir ve sürüş oligodendrocyte farklılaşma sırasında oksijen ve glikoz tükenmesi kontur modelleri9 sırasında nöronlar korunması ve neurite yapılan teşvik re-myelination8, dahil Medulla Spinalis Yaralanmalarında10modelleri.
Bu gliyal hücreler çalışma anlamakta ve neuroinflammation cevaben işleme önemli bir yönü temsil eder. Daha fazla araştırma yapılması tedavi potansiyel bir microglia modülasyon neuroinflammatory hastalıkları için açıklanan Protokolü sağlar.
Mikroglial etkinleştirme nöroprotektif rolü doğru modülasyon koşulları11,12,13aralıkta gözlenmiştir. Böylece, şimdiki anlayış ve daha fazla eğitim modülasyon mikroglial etkinleştirme içinde in vitro ve in vivode dahil olmak üzere çeşitli modellerinin kullanımı gerektiren kritik geliştirmektedir. Vitro çalışmalar nedeniyle daha fazla etkinlik, daha düşük maliyet ve yeteneği bir izole hücre nüfus araştırmak için önemli bir araç temsil eder.
Edebiyat microglia fare beyni, kimden verimli bir şekilde iyi canlılığı ve yüksek saflıkta ile yüksek verim örnek üretmeye meydan yalıtım için açıklanan protokoller bir dizi vardır. Manyetik Ayırma ve uzun süreli karma gliyal kültürleri sallayarak tarafından birincil microglia yalıtım sık kullanılan yöntemlerdir. Kişisel deneyim sayesinde, manyetik sütun tıkalı hücresel enkaz yüksek derecede oldu bulundu. Böylece, aşağıdaki iletişim kuralı, hangi CD11b manyetik ayırma tarafından takip bir ilk yoğunluk gradient Santrifüjü adım içermektedir kullanılmıştır. Aşağıda açıklanan protokol son derece saf bir örnek yeterli miktarda üretmek için optimize edilmiştir. Yüksek saflığı ve kısa sürede nedeniyle avantajlıdır — bir gerçekleştirebilir deneyleri 2 gün içinde 2-3 hafta kültür için gerek kalmadan. Bu iletişim kuralı potansiyel olarak birincil fare astrocytes yalıtım için adapte edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia çevre uyaranlara tarafından değiştirilmiş hem pro – ve anti-inflamatuar, yeteneği vardır. Önceki çalışmalar microglia harekete geçirmek modülasyon neuroprotection görüşmek göstermiştir. Yeteneklerini nöronlar koruma sağlamak ve hasarı onarmak için bu karmaşık hücrelerin geçerli anlayışı ilerletmek için daha fazla araştırma gerektirir. Böylece, yüksek saflıkta birincil microglia işlemleri olan bir önemli ve yararlı bir tekniktir. Bu son derece saf birincil microglia 2 gün i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
References
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).
- Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
- Uwe-Karsten, H., Helmut, K. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).
- Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O’Banion, M. K. Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed. Journal of neuroinflammation. 11, 98 (2014).
- Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).
- Guohua, W., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864 (2013).
- Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2009).
- Veronique, E. M., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nature Neuroscience. 16 (9), 1211 (2013).
- Hu, X., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia. Stroke. 43 (11), 3063 (2012).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).
- Suzuki, T. Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role. Journal of neuroscience research. 83, (2006).
- Bedi, S. S. Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury. Stem cells translational medicine. 2, (2013).
- Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection. Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System. PLOS ONE. 11 (2), e0150290 (2016).
- Leaw, B., et al. Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury. Stem cell research & therapy. 8 (1), 46 (2017).
- Moujalled, D., et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).
